盧會(huì)英,沈青春,寧宜寶

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所農(nóng)業(yè)部獸藥創(chuàng)新與生物安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100081)

豬支原體肺炎在我國(guó)20世紀(jì)40年代就有散在發(fā)生,1953年開(kāi)始流行,以后蔓延全國(guó),造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。豬肺炎支原體在呼吸道定居是通過(guò)特定結(jié)合到黏膜上皮細(xì)胞的纖毛上完成的。開(kāi)始支原體粘附在完整的氣管纖毛表面,爾后逐漸殘蝕纖毛,直至造成纖毛大面積的或全部脫落[2]。這種相互間的作用經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與纖毛粘附因子有關(guān)。張啟敬(1995)[3]發(fā)現(xiàn)單克隆抗體(MAbF2G5)和(MAbF1B6)可抑制豬肺炎支原體粘附在豬氣管的纖毛上。這兩個(gè)單抗可以識(shí)別p97蛋白,純化的p97蛋白可結(jié)合在纖毛上抑制豬肺炎支原體的粘附[4-5],最后證明了97 k D的膜蛋白p97為纖毛粘附因子。單克隆抗體MAbF 1B6為纖毛阻斷抗體它識(shí)別p97基因中的重復(fù)序列區(qū)R1區(qū),所以說(shuō)明R1區(qū)為p97蛋白中的主要抗原決定區(qū)[6]。結(jié)合豬肺炎支原體的免疫學(xué)特點(diǎn),主要引起的是黏膜免疫和細(xì)胞免疫,其中黏膜免疫在控制該病的發(fā)生中起著重要的作用[7],如果使用的疫苗可以引起機(jī)體產(chǎn)生很高的黏膜免疫水平就可以很好的保護(hù)黏膜系統(tǒng),對(duì)阻斷豬肺炎支原體的侵入有很大的幫助。目前研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的不耐熱腸毒素B亞單位是有效的黏膜免疫佐劑,因此此試驗(yàn)設(shè)計(jì)將LTB序列和R1序列進(jìn)行重組表達(dá),然后觀察此重組蛋白的免疫原性以及其對(duì)機(jī)體的黏膜免疫水平的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)豬肺炎支原體232株和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌C83901均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。pMD18-T載體,p ET 28-a(+)原核表達(dá)載體,大腸桿菌BL21(DE3)和TOP10感受態(tài)細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 高保真DNA合成酶pfu購(gòu)自S tratagene公司,Taq DNA聚合酶購(gòu)自鼎國(guó)生物公司,限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司,T 4連接酶購(gòu)自TaKaRa公司,質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司,凝膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司,2×YT培養(yǎng)基,預(yù)染蛋白 Marker購(gòu)自NEB公司,DNA Marker DL-2000和DL-15000購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3 血清 抗豬肺炎支原體232株的兔高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Sigma公司。

1.4 目的片段R1和LTBR1的擴(kuò)增 分別以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株232的全基因序列和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌全基因序列為模板,根據(jù)GenBank發(fā)布的 p97基因(U50901)和LTB基因序列(M17873)設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段R1和LTBR1的引物:

分別在片段R1和LTBR1的兩端引入了酶切位點(diǎn)Bam HⅠ和Hin dⅢ,對(duì)應(yīng)于表達(dá)載體p ETa-28(+)中的插入位點(diǎn)。

LTB與R1片段的融合片段LTBR1的擴(kuò)增采用的為重疊延伸PCR的方法。

1.5 pMD18-T-rR1和 p MD18-T-rLTBR1克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行純化回收后進(jìn)行加A,回收的片段通過(guò)T 4DNA Ligase連接到pMD18-T載體上。得到了質(zhì)粒pMD18-T-rR1和pMD18-T-rLTBR1。然后轉(zhuǎn)化到克隆性感受態(tài)細(xì)胞TOP 10中。通過(guò)抗性篩選和菌落PCR的方法得到陽(yáng)性菌落,然后對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定最后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的菌株進(jìn)行保菌,放于-70℃冰箱保存。

1.6 p ET-28a(+)-rLTBR1和p ET-28a(+)-rR1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 對(duì)上述陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切,回收酶切片段,同樣對(duì)p ET-28a(+)空載體進(jìn)行Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切,然后連接酶切后的目的片段和表達(dá)載體,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆性感受態(tài)細(xì)胞 TOP 10中,通過(guò)卡那抗性和質(zhì)粒鑒定的方法篩選出陽(yáng)性菌落,然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,鑒定正確后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。同樣通過(guò)卡那抗性篩選和提取質(zhì)粒后酶切鑒定的方法得到陽(yáng)性菌落,然后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的菌株保菌,放于-70℃冰箱保存。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)按照Novagen的p ET系統(tǒng)操作手冊(cè)進(jìn)行:將 p ET-28a(+)-rLTBR1和p ET-28a(+)-rR1表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)的宿主菌中,37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng),取適量菌液(一般為1‰比例)接種于含50μg/m L卡那霉素的2×YT液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm=0.6),然后加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/m L。在30℃低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。同時(shí)設(shè)立p ET-28a(+)空載體的受體菌和未誘導(dǎo)對(duì)照。對(duì)誘導(dǎo)的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,按照文獻(xiàn)(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)[8]進(jìn)行:離心收集菌體,然后PBS洗滌一次,其中一半按照1∶20體積加入裂解液重懸菌體進(jìn)行裂解,其中加入1 mg/m L溶菌酶和 5μg/m L的蛋白酶抑制劑PMSF,冰上作用30 min后,進(jìn)行超聲波破碎,工作5 s間隔5 s,200次重復(fù)。然后離心得到上清和沉淀,分別取樣加入等體積的2×凝膠上樣緩沖液。另一半取一定的樣品直接取沉淀加入等體積的2×凝膠上樣緩沖液,這兩份樣品煮沸3～5 min。然后12000 r/min離心 10 min。進(jìn)行 Tricine SDSPAGE電泳檢測(cè)。然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色1～2 h,之后加入脫色液脫色至條帶清晰。對(duì)鑒定正確的蛋白進(jìn)行0.22μm NC膜的濕轉(zhuǎn),然后進(jìn)行Western blot分析。免疫印跡 Western blot試驗(yàn)步驟(參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[8]):電轉(zhuǎn)后的膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉4℃過(guò)夜,然后以兔抗Mhp的高免血清作為一抗,以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗,分別于37℃孵育1 h,作用后用PBS洗滌 3次,然后用DAB進(jìn)行顯色,觀察分析結(jié)果。

1.8 誘導(dǎo)蛋白的純化和蛋白定量 所表達(dá)的目的蛋白為帶有 His標(biāo)簽的融合蛋白,所以采用Ni-N TA His.Bind Resin進(jìn)行親和層析純化,按照Novagen公司的Ni-NTA His.Bind Resin說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用Nano Drop ND-1000 spectrophotometer在280 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行蛋白定量。

2 結(jié)果

2.1 目的片段擴(kuò)增 PCR方法擴(kuò)增R1片段和LTB以及重組片段LTBR1得到了大小分別為280 bp,320 bp,600 bp的目的片段。將目的片段插入到p MD18-T載體和pET-28a(+)表達(dá)載體,分別對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序,鑒定和測(cè)序結(jié)果完全正確。

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 對(duì)轉(zhuǎn)化了表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a(+)-LTBR1和p ET-28a(+)-R1的宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo),分別表達(dá)得到了30 k D和17 kD大小的目的蛋白。經(jīng)過(guò)對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物的表達(dá)水平和可溶性分析,結(jié)果是目的蛋白占菌體總蛋白量的37%,R1蛋白主要是可溶性表達(dá),LTBR1蛋白以包涵體形式表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,表達(dá)的目的蛋白能夠與兔抗Mhp的高免血清結(jié)合。

3 討論

R1區(qū)是纖毛粘附因子p97粘附纖毛的主要決定區(qū),該區(qū)的功能通過(guò)結(jié)合纖毛的單克隆抗體F 1B6進(jìn)行了驗(yàn)證。該蛋白免疫動(dòng)物如果產(chǎn)生的主要為黏膜抗體,就可以很大程度的保護(hù)黏膜系統(tǒng),阻斷支原體與黏膜的粘附作用,從而減少支原體感染。結(jié)合當(dāng)前黏膜免疫佐劑的研究進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)LTB作為黏膜免疫佐劑在黏膜免疫中起著重要的作用,并且這種方法在許多主要以侵襲黏膜致病的病原體的研究中得到了應(yīng)用[9]。因此設(shè)計(jì)重組表達(dá)了融合蛋白rLTBR1,目的在于研究該蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物后起到的免疫保護(hù)作用如何,LTB與R1共同作用是否提高了機(jī)體的黏膜免疫水平。本試驗(yàn)構(gòu)建的重組菌表達(dá)的蛋白通過(guò)SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)分析,rR1和 rLTBR1蛋白均為特異性蛋白。本試驗(yàn)為開(kāi)發(fā)有效的提高黏膜免疫水平的基因工程疫苗研究打下了基礎(chǔ)。

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