郭 楊,林 華,郭宇飛,郭萬(wàn)柱

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心,四川雅安625014;2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局,四川成都610041;3.金陵科技學(xué)院動(dòng)科院,江蘇 南京 200038)

高致病性豬藍(lán)耳病是由一種帶有Nsp2部分缺失的、對(duì)豬呈高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的疫病[1-3]。豬是惟一的感染動(dòng)物。本病沒有明顯的季節(jié)性,一年四季均可發(fā)生。主要發(fā)生在惡劣氣候條件和飼養(yǎng)環(huán)境下。高度傳播性、污染性是高致病性PRRSV的一個(gè)突出特征。與經(jīng)典毒株相比,病原的基因序列變化主要是在Nsp2區(qū)缺失了30個(gè)氨基酸。故有學(xué)者認(rèn)為病毒基因的缺失使其毒力明顯增強(qiáng),決定了其極強(qiáng)的致病性,經(jīng)典毒對(duì)豬沒有流行毒如此高的致死率[4-8]。

1 材料

主要儀器與試劑:質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)-mega公司;高致病性 PRRSV SC-JX01株、SC-JX01株N sp2重組質(zhì)粒均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存并提供;高速冷凍離心機(jī):法國(guó)Jouan公司;PCR試劑盒:博瑞克生物技術(shù)公司產(chǎn)品;DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):均為TaKaRa公司(大連)產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 重組質(zhì)粒的提取 將含有高致病性PRRSV Nsp2基因的重組質(zhì)粒菌種接種于LB固體培養(yǎng)基,在平板上劃線后于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～16 h,挑取單個(gè)白色菌落接種于含Amp 100μg/m L的LB液體培養(yǎng)基中37℃振搖下培養(yǎng)過(guò)夜,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。參照質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 用克隆N sp2基因的上下游引物(引物由林華提供),以重組質(zhì)粒pMD-Nsp2為模板,進(jìn)行陽(yáng)性重組質(zhì)粒的PCR鑒定。反應(yīng)體系為50μL,反應(yīng)程序?yàn)?95℃5 min;94℃1 min,56℃1 min,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);再 72℃7 min,取適量PCR產(chǎn)物電泳鑒定片段大小。挑取單個(gè)重組質(zhì)粒菌株經(jīng)培養(yǎng)送上?；瞪锕こ逃邢薰緶y(cè)序,并與參考序列比較。

2.3 Nsp2基因的序列分析 運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)PRRSV不同毒株的Nsp2基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)并繪制遺傳進(jìn)化樹。國(guó)內(nèi)外的參考毒株為[9]:VR2332(A Y150564),16244B(NC-001961),Resp-PRRS MLV株(AF 066183),MLV Resp PRRS/Repro株(AF159149),LV株(M96262),CH1-a株(AY032626)、BJ-4 株(AF331831)、HB-1(sh)/2002株(AY150312)、HB-2(sh)/2002株(AY262352)。已發(fā)表的6個(gè)高致病性PRRSV毒株[10]為:JXA1株(EF112445)、HEB1株(EF 112447)、HUB2株(EF 112446)、SHH 株(EU 106888)、LN 株(EU 109502)、GD 株(EU 109503)。

2.4 利用DNAStar軟件對(duì)SC-JX01株Nsp2基因推導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行親水性、表面可能性和抗原性分析。

3 結(jié)果

3.1 重組質(zhì)粒pMD-Nsp2的鑒定 以質(zhì)粒DNA為模板,用Nsp2克隆引物擴(kuò)增出約950 bp左右的條帶,說(shuō)明插入片段為目的片段。重組質(zhì)粒提取成功。

3.2 SC-JX01株N sp2基因的序列分析

3.2.1 Nsp2基因的核苷酸序列分析 序列分析結(jié)果表明,N sp2基因序列與傳統(tǒng)毒株相比缺失90個(gè)核苷酸。與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株的Nsp2基因序列相似性很高為98.1%～99.1%(見圖1);與美洲型標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332、疫苗株MLV和早期國(guó)內(nèi)分離的PRRSV經(jīng)典株的相似性較低。系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)分析表明,SC-JX01株Nsp2序列與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株遺傳距離很近,均屬于PRRSV美洲株;與PRRSV歐洲型LV株的遺傳距離較遠(yuǎn)。

3.2.2 Nsp2基因的推導(dǎo)的氨基酸序列分析 與普通PRRSV相比,本試驗(yàn)獲得的Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列變異較大(見圖3),不但存在點(diǎn)突變還存在缺失,共缺失 30個(gè)氨基酸。與國(guó)內(nèi)高致病性PRRSV分離株 JXA1株、HEB1株、HUB2株、SHH株、LN株、GD株相比,缺失相同,僅存在少數(shù)點(diǎn)突變;SC-JX01株與6個(gè)變異毒株高度同源,相似性均大于95.5%,其中 SC-JX01株與 JXA1株、SHH株的相似性最高為98%;但與 VR-2332、MLV株等同源性則較低。

3.3 SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸序列的親水性、表面可能性及抗原性分析結(jié)果 通過(guò)對(duì)Nsp2基因編碼的氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸由于第534位～第562位發(fā)生缺失,造成親水性區(qū)域比VR2332株寬,高抗原指數(shù)區(qū)域比VR2332株窄(圖4)。序列分析發(fā)現(xiàn),SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸所表現(xiàn)的抗原性及其蛋白質(zhì)表面的 可能性與其親水性區(qū)域位點(diǎn)表現(xiàn)出一致的性質(zhì)。

4 討論

高志強(qiáng)[9]對(duì)國(guó)內(nèi)毒株的序列比較結(jié)果表明Nsp2區(qū)的變異較大,我們選擇擴(kuò)增的這一區(qū)域在Nsp2序列中變異是最大的。此次分離的SC-JX01株Nsp2基因核苷酸序列中一處缺失3 bp;另一處連續(xù)缺失87 bp,與6個(gè)變異株的Nsp2基因序列高度相似,與早期分離的PRRSV毒株序列差異較大;在獲得的SC-JX01株Nsp2基因推導(dǎo)編碼氨基酸序列也存在2處缺失,這與童光志等[10]研究結(jié)果相似。

有學(xué)者認(rèn)為以Nsp2基因的部分缺失為特征的PRRSV對(duì)豬是高致病性的[10-11]。從高熱病中分離到的病毒,在Nsp2區(qū)域缺失30個(gè)氨基酸,同時(shí)該病毒引起的較高發(fā)病率、病死率,能直接通過(guò)Marc-145細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,提示Nsp2區(qū)域氨基酸的突變與缺失可能改變了PRRSV對(duì)細(xì)胞或組織的嗜性,或者Nsp2區(qū)域氨基酸的缺失與毒力增強(qiáng)有關(guān)系。

變異株的Nsp2基因編碼的氨基酸由于第534位-第562位發(fā)生缺失,造成親水性和抗原指數(shù)與VR2332株比較有非常大的變化。這使PRRSV變異株的致病能力大大加強(qiáng),SC-JX01株和6個(gè)變異株序列特征高度一致,而與以前的毒株又有明顯差異,尤其是N sp2基因的缺失和結(jié)構(gòu)蛋白基因序列的突變,這些變化中哪些對(duì)毒力的改變起決定作用還有待進(jìn)一步的研究[12]。

本研究對(duì)克隆的SC-JX01株Nsp2基因進(jìn)行了序列測(cè)定,與美洲型標(biāo)準(zhǔn)株VR2332和變異株等相應(yīng)序列比較分析,結(jié)果顯示此次分離的SC-JX01株Nsp2基因與變6個(gè)異株Nsp2基因高度同源,與美洲型標(biāo)準(zhǔn)株VR2332等以前流行的經(jīng)典型PRRSV Nsp2基因親緣關(guān)系都較遠(yuǎn),說(shuō)明我國(guó)現(xiàn)在流行的PRRSV已發(fā)生較大的變異,這也可能是用傳統(tǒng)的疫苗免疫無(wú)法抵抗高致病性(變異型)豬藍(lán)耳病病毒的原因。

[1] 周慶雨.豬“無(wú)名高熱病”病因調(diào)查[J].福建畜牧獸醫(yī),2003,25(1):12.

[2] 陳健雄.豬夏季無(wú)名高熱病的發(fā)生與防制[J].養(yǎng)豬,2006(3):31-32.

[3] 王凌黎,楊建華,符小軍.高溫季節(jié)“高熱病”的特點(diǎn)及防治措施[J].中國(guó)豬業(yè),2006(3):35-36.

[4] 明心中,高琳.江西省部分地區(qū)生豬高熱病發(fā)病情況及防治[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志,2006(4):33-34.

[5] 王興龍,柏坤桃,姜平,等.1株臨床高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39(8):12-16.

[6] 馬靜云,李浩波,王玲玲,等.高致病性PRRSV的分離及其Nsp2和ORF5基因的序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008,38(8):650-657.

[7] An T Q,Zh ou Y J,Liu G Q,etal.Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein 5 of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006:Coexistence of tw o NA-subgenotypes with great diversity[J].Vet Microbiol,2007,123(1-3):43-52.

[8] TIAN K G,Yu X,ZHAO T Z,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the u nique h allmark[J].PLOS ONE,2007,2(6):526.

[9] 高志強(qiáng),郭鑫,楊漢春,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒缺失變異株的基因組特征[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,36:578-584.

[10]童光志,周艷君,郝曉芳,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,5(29):323-326.

[11]寧宜寶,鄭杰,張純萍,等.我國(guó)南方豬高熱病的研究(II)[J].中國(guó)獸藥雜志,2007,41(1):14-18.

[12]John son C,Wanqin Y,Mu rtaugh M.Cross-reactive antibody responses to Nsp1 an d Nsp2 of procine reproductive and respiratory syndrome viru s[J].J Gen Virol,2007,88:1184-1195.