王 婷,蔣 原,唐泰山,張常印,祝常青

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,河南 洛陽 471003;2.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇 南京 210095)

空腸彎曲菌是一種在世界范圍廣泛流行的常見的人畜共患病病原菌,大量存在于各種野生或家養(yǎng)動物的腸道內(nèi),引起牛和綿羊流產(chǎn),雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病[1]?？漳c彎曲菌的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,具有廣泛的抗原多樣性或差異性,目前已知有近60個血清型,且還有增加的趨勢?？漳c彎曲菌的菌體外膜上的抗原成分主要為蛋白質(zhì)和脂多糖(O抗原)及鞭毛(H抗原)[2]。

鞭毛是空腸彎曲菌一個重要的毒力因子,鞭毛所提供的動力和粘附作用,可能參與細菌在細胞表面的吸附,以及其后的侵襲與定居過程,因而在其致病機制中起重要作用。鞭毛微絲由兩個大小相近約為1.7 kbp高度同源的基因fla A和fla B編碼,兩者同源性為95%,目前有關(guān)鞭毛基因的研究多集中于fla A基因,fla A基因失活,空腸彎曲菌也將削弱細菌的毒力。有報道說鞭毛抗體可能是一種保護性抗體,因而鞭毛抗原是空腸彎曲菌疫苗的有力候選者[3]。

從空腸彎曲菌菌體中直接大量提取蛋白純品較為困難和繁雜,在實際工作中難以被應(yīng)用,而基因工程技術(shù)則為此提供了有利途徑。由于空腸彎曲菌fla A基因(G+C)%含量低(36.4%),且與原核表達體系E.coli密碼子兼并性較差,本試驗根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的ATCC29428的基因序列,對 fla A基因進行了改造、表達,并分析了表達蛋白的抗原性。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 空腸彎曲菌ATCC29428、大腸桿菌BL21(DE3),質(zhì)粒pET-28a(+)由江蘇出入境檢驗檢疫局保存。

1.2 主要試劑及儀器 DL-2000 DNA Maker、TaKaRa Taq TM 試劑盒、低分子量蛋白Marker、Eco RⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T 4 DNA連接酶、TaKa Ra小量細菌質(zhì)粒提取試劑盒、TaKaRa DNA快速純化試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司;IPTG、完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA):Sigm a公司產(chǎn)品分裝,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

PCR儀2400型:Bio-Rad公司;核酸電泳裝置、垂直蛋白電泳裝置:北京六一儀器廠;超聲破碎儀:CPX600型,Cole Parmer產(chǎn)品;J2-21高速冷凍離心機:美國貝克曼公司。

ICR小鼠購自南京軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心,約10周齡,體重25～30 g。

1.3 fla A基因的改造和表達

1.3.1 fla A基因組的改造合成 根據(jù)GenBank已公布的空腸彎曲菌和ATCC29428 fla A基因測序結(jié)果,利用DNAStar軟件進行同源性比較分析,利用VectorN TI軟件進行基因組的改造,并添加酶切位點,送寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 在含30μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中接種含pET-28a(+)質(zhì)粒的宿主菌 E.coli DH5α。37℃振搖過夜,按 TaKa-Ra小量質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行,提取的質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用質(zhì)粒8μL,10×buffer 2μL,Bam HⅠ1μL,Xho I 1μL,補 dd H2 O至 20μL的酶切體系37℃雙酶切3 h酶切后的質(zhì)粒經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段和質(zhì)粒,在紫外燈下將目的條帶切下,用TaKaRa DNA快速純化試劑盒回收凝膠中的目的條帶,具體步驟按試劑盒說明書進行操作,回收產(chǎn)物用 T 4 DNA連接酶16℃連接過夜,以待轉(zhuǎn)化。-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

參照《分子克隆實驗指南》的方法[4],制備E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞,將連接過夜的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,經(jīng)卡那抗性篩選后挑取單菌落,進行酶切鑒定,將陽性克隆送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.3.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達 將鑒定后的含重組質(zhì)粒的細菌在LB培養(yǎng)基上挑取單菌落,接種LB培養(yǎng)基中(含Kan 30μg/m L),37℃振搖培養(yǎng),當濃度達到OD6000.4～0.6時加入IPTG至終濃度1 mmol/L,37℃劇烈振搖培養(yǎng)6 h,分別于誘導(dǎo)后2、4、6 h取1.5 m L菌液,12000 g離心5 min,棄上清,沉淀用PBS洗滌兩次,加入 100μL 1×蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min,12000 g離心5 min,取上清15μL,用 5%的濃縮膠和 12%分離膠進行SDS-PAGE電泳,分析蛋白條帶。

1.3.4 重組蛋白表達形式分析及其純化 收100 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h菌體,PBS洗滌2次,加20 m L超聲破碎液(50 mmo L/L NaH2 PO4,300 mmol/L NaCl,p H8.0)重懸菌體,在冰浴中超聲破碎細菌,功率為400 W,超聲 5 s,停5 s,80個循環(huán),超聲兩遍。于4℃12000 g離心10 min,回收上清,沉淀用1 m L PBS重懸。分別取12μL加3μL 5×SDS上樣緩沖液后煮沸5～10 min,12%分離膠,5%濃縮膠進行SDS-PAGE分析重組蛋白表達形式。若蛋白存在于上清中時,取超聲碎菌后的上清液 ,用Ni2+-N TA樹脂層析柱親和層析純化,方法按說明書,分段收集洗脫液 ,進行SDS-PAGE電泳 ,分析純化效果.純化后依次加入3倍柱體積的去離子水去除EDTA,3倍柱體積的1×Strip Buffer洗柱,100 mmol/L EDTA儲存柱。

1.4 重組蛋白抗原性試驗 用小鼠抗空腸彎曲菌全菌血清以 Western blot檢測純化的重組蛋白FLA的免疫反應(yīng)性;用純化的FLA蛋白以PBS分別稀釋至400μg/m L,加入等量的弗氏完全佐劑乳化(1∶1)后,背部皮下免疫 ICR小鼠,0.2 mL/只;2周后以弗氏不完全佐劑乳化(1∶1)進行二次免疫,4周后再加強免疫1次,同時設(shè)立 E.coli BL 21(DE3)-p ET 28a(+)-fla A未誘導(dǎo)滅活全菌免疫對照組和空白對照組。二次免疫后,每周采血分離血清,滅活空腸彎曲菌全菌包被,間接ELISA檢測外周血中相應(yīng)抗體的效價。

2 結(jié)果

2.1 fla A基因組的改造合成 根據(jù)空腸彎曲菌ATCC29428的基因序列和測序結(jié)果利用 Vector NTI軟件進行基因組的改造,由寶生物工程(大連)有限公司測序合成 fla A(588 bp),改造后 fla A基因組與原基因組基因同源性為69.1%,(G+C)%含量為56.1%。

2.2 重組質(zhì)粒的表達 將重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-fla A進行酶切和PCR擴增后,電泳可見588 bp特異性條帶(圖1),對鑒定正確的質(zhì)粒,送寶生物工程(大連)有限公司測序,結(jié)果表明插入片段與預(yù)期結(jié)果完全一致。

2.3 重組質(zhì)粒的表達 重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-fla A轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coli BL 21(DE3),經(jīng) 1 m mol/L IPTG誘導(dǎo)表達1～6 h后,通過 SDSPAGE考馬斯亮藍染色分析總細胞蛋白,可見特異性表達帶(圖2)。由圖可知,用終濃度1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后,表達量達到最大,占細菌蛋白總量的50%,相對分子量為25 k Da。

2.4 重組蛋白表達形式、純化及反應(yīng)原性鑒定將誘導(dǎo)菌超聲破碎后 ,分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE。上清液電泳后可見明顯的特異性蛋白表達帶 ,說明表達的重組蛋白以可溶性形式存在于胞質(zhì)中。超聲破碎上清液用 Ni2+-N TA樹脂層析柱親和層析后 ,用洗脫液洗脫吸附在Ni2+-N TA樹脂上的蛋白質(zhì) ,收集洗脫液經(jīng)SDS-PAGE(圖3),Western bolt結(jié)果證實 ,小鼠抗空腸彎曲菌全菌抗體能與 FLA結(jié)合,FLA具有反應(yīng)原性(圖4)。

2.5 重組蛋白的免疫原性 經(jīng)親和層析柱層析獲得純化的重組蛋白FLA,濃度達到2.68 mg/m L,加佐劑免疫 ICR小鼠,6周后,用全菌包被的間接ELISA測的FLA免疫組血清效價為1∶25600,未誘導(dǎo)滅活全菌免疫組為1∶200(表1)。

表1 小鼠抗FLA血清ELISA效價的測定

3 討論

由細菌純化大量完整的目的蛋白十分困難,這勢必影響蛋白的研究與利用。因此我們用E.coli原核表達系統(tǒng)對空腸彎曲菌可能的毒力因子FLA的基因片段進行克隆表達。

由于空腸彎曲菌(G+C)%含量低 fla A(36.4%),且與E.coli原核表達系統(tǒng)表達載體密碼兼并性較差,不易于表達,試驗中曾使用過p ET-32a(+)、pET-30、pGEX-6p-1多種載體及宿主菌,結(jié)果都不能表達,或表達量極低(＜10%)。根據(jù)測序結(jié)果利用Vector NTI軟件進行基因組的改造,并添加酶切位點,用改造合成的序列 fla A構(gòu)建了pET-28a(+)-fla A重組質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)化 E.coli BL 21(DE3)后 ,在 IPTG誘導(dǎo)下能高效表達分子量為25 k Da的目的蛋白FLA,由于質(zhì)粒 p ET-28a(+)在多克隆位點上游有一段 H is-Tag和 T 7-Tag編碼序列(分子量約為3.5 k Da)與蛋白融合表達,所以重組蛋白 FLA分子量與預(yù)計的理論值是相符的,蛋白表達量最大可達細菌總蛋白的50%左右,以純化蛋白做Western bolt和小鼠免疫試驗證明,該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。

由于空腸彎曲菌的抗原成分較為復(fù)雜,除鞭毛蛋白外,主要外膜蛋白(MOMP)、趨化蛋白(CHEY)、粘附蛋白(PEB)、脂多糖(LPS)、細胞致死性毒素(CDT)等[5-9]在激活機體的免疫機制的過程中也具有重要的作用。目前對于這些蛋白的作用尚不明確,如能對其各個基因進行克隆表達,對功能進行充分研究,篩選出其具有免疫保護作用的表面抗原成分,并通過基因工程構(gòu)建相應(yīng)的疫苗[10],必將對空腸彎曲菌所致的食源性腸炎及繼發(fā)的GBS等自身免疫性疾病的防治有極重要的意義。

[1] Mun roe D L,Prescott J F,Penner J L.Camp ylobacter jejuni and Campylobacter coli serotypes isolated from chickens,cattle,and pigs[J].Clin Microbiol,1983,18:877-881.

[2] Carrillo C D,Taboada E,Nash J H,et al.Genome-w ide expressionanalyses of Ca mp ylobacter jejuni NCT C11168 reveals coordinate regu lation of motility and viru lence by flhA[J].Biol Chem,2004,279(19):20327-20338.

[3] Young G M,Schmiel D H,Miller V L.New pathw ay for the secretion og virulence fatorsby bacteria:the flagellar esportapparatus functionsas a protein-secretion system[J].Proc Natl Acad Sic USA,1999,96(11):6456-6461.

[4] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis J.分子克隆實驗指南[M].金冬雁 ,黎孟楓,侯云德,等譯.北京:科學(xué)出版社,1999:296-298.

[5] Taylor D E,Chang N.Immu noblot and enzyme-linked immunosorbant assays of Camp ylobacter major outer membrane protein and application to the differentiation of Cam py lobacter species[J].Mol Cell Prob es,1987,1:261-274.

[6] Yao R,Burr D H,Guerry P.CheY-mediated m odu lation of Camp y lobacter jejun i viru lence[J].Mol Microbio,1997,23(5):1021-1031.

[7] Pei Z,Buru coa C,Grign on B,et al.Mu tation in the peblA locus of cam p lobacter jejuni redu ces interactions w ith epithelial cells and in-testinal colonization of mice[J].Infect Immun,1998,66(3):938-943.

[8] Brooks B W,Mih owich J G,Blais B W,et al.Spcecificity of monoclonal antib odies to Cam py lobacter jejuni lipopolysaccharidide antigens[J].Immunol Invest,1998,27:257-265.

[9] Gonzalezetal I,G rant K A,Richardson P T,et al.Specific iden tification of the enteropathogens Camp ylobacter jejuni and Camp y lobacter coli by using a PCR test based on the ceu E gen e encodin g a putative Viru len ce determinant[J].Clin Microbiol,1997,35(3):759-763.

[10]Lee L H,Bu rg Edw arg,Baqar S,et al.Elvaluation of a truncated recombinant flageiiln sub unit vaccine against Camp ylobacter jejuni[J].Infect Im mun,1999:355-359.