戚峰，朱理瑋，何向輝，邱宇杰，王鵬志

中華眼鏡蛇毒結合免疫抑制劑控制異種移植排斥反應

戚峰，朱理瑋，何向輝，邱宇杰，王鵬志

目的：探討協(xié)調性和非協(xié)調性異種移植免疫排斥不同機理，尋找中華眼鏡蛇毒結合免疫抑制藥物的最佳治療方案。方法：采用改良的Heron頸部套袖法分別建立小鼠對大鼠，豚鼠對大鼠異種異位心臟移植模型，受體大鼠各分為4組：1組僅行異種移植不給藥；2組聯(lián)合應用中華眼鏡蛇蛇毒因子、環(huán)磷酰胺、FK506；3組將2組中華眼鏡蛇毒劑量加倍；4組在2組用藥組合基礎上再加用前列腺素E1。結果：給藥組移植供心存活時間明顯延長，尤其在小鼠對大鼠模型給予PGE1后（小鼠4組6.92 d）及豚鼠對大鼠模型蛇毒因子劑量加倍后（豚鼠3組27.33 h）。兩類模型給藥后CH50，異種抗體IgM明顯降低，并逐漸出現(xiàn)急性血管排斥反應改變。結論：異種移植后的超急性排斥反應和急性血管排斥反應存在著密切的相互關聯(lián)，是統(tǒng)一的排斥過程中具有不同特點的兩個階段。中華眼鏡蛇毒聯(lián)合多種免疫抑制藥物可控制異種排斥，尤其對非協(xié)調性異種移植有更大的作用。

異種移植；心臟；超急性排斥；急性血管排斥；中華眼鏡蛇蛇毒因子

為探討協(xié)調性和非協(xié)調性異種移植免疫排斥不同機理，以及尋找適宜的藥物組合治療方案，我們分別建立小鼠心臟移植到大鼠的協(xié)調性異種心臟移植模型和豚鼠心臟移植到大鼠的非協(xié)調性異種心臟移植模型，并聯(lián)合應用中華眼鏡蛇蛇毒（chinese cobra venom,CCV）、環(huán)磷酰胺（CTX）、FK506以及前列腺素E1（PGE1），控制異種移植后超急性和急性血管排斥反應，為異種移植的免疫排斥研究和臨床應用提供借鑒。

1 材料

1.1 藥品中華眼睛蛇蛇毒由廣州蛇毒研究所提供，為凍干粉劑，用雙蒸水稀釋，配成蛇毒溶液。環(huán)磷酰胺是江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產品，批號0008202。FK506（商品名普樂可復，Prograf）是愛爾蘭Fujisawa公司產品，批號5A3043G。前列腺素E1是哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司產品，批號20000601。1.2動物供體動物分別為雄性昆明小鼠，體重25～35 g；雄性豚鼠，體重150～200 g；受體為雄性Wistar大鼠，體重為200～250 g。均由天津市藥物研究所動物中心提供。

1.3 器材包括德國蔡司雙人雙目顯微鏡，顯微手術器械，美國B.D.公司FACSCalibur型流式細胞儀等。

2 方法

2.1 異種異位心臟移植模型的建立根據(jù)Heron頸部套袖法的手術模式加以改進，建立小鼠對大鼠異種異位心臟移植模型[1]。供、受體均以4%水合氯醛按7.5 mg/kg腹腔內注射麻醉，分離受體大鼠右側頸外靜脈和頸總動脈，離斷后近心端分別置血管套管，以微血管夾夾閉血管。供體小鼠開胸，經(jīng)下腔靜脈注入肝素鹽水（50 u/mL）0.5 mL，使全身血液肝素化。自下腔靜脈插管注入4℃含有25 u/mL肝素的乳酸鈉林格液，灌注心臟。仔細分離、剪斷供心主動脈及肺動脈，其余血管集束結扎后剪斷，摘取供心。將供心肺動脈與受體大鼠右頸外靜脈套管連接，主動脈與右頸總動脈套管連接。松開微血管夾，可見供心恢復血運，并出現(xiàn)自主節(jié)律性搏動。同法建立豚鼠對大鼠異種異位心臟移植模型，將豚鼠供心左肺動脈與受體大鼠右頸外靜脈套管連接，供心無名動脈與右頸總動脈套管連接。

2.2 術后觀察術后可在大鼠頸部很容易的看到供心的搏動，對于小鼠供心每12 h觀察1次跳動情況；對于豚鼠供心，受體大鼠如術前未給予免疫抑制藥物，因其將在短時間內排斥，可直視下觀察供心排斥情況，給藥后，需隨時觀察。從供心復跳至完全停止跳動的時間作為供心存活時間。

2.3 實驗分組和給藥方法對于兩類模型，均將受體大鼠分為：1組為對照組；2組為CCV、CTX、FK506組；3組為CCV(加倍劑量)、CTX、FK506組；4組為CCV、CTX、FK506、PGE1組。每組6只大鼠。各組給藥方法見表1。

表1 異種心臟移植模型各實驗組圍手術期免疫抑制藥物給藥方案

2.4 補體總活性測定小鼠→大鼠模型每組于術后1 d，豚鼠→大鼠模型每組于術后5 min，及排斥發(fā)生時，經(jīng)左頸外靜脈取血0.5 mL，收集血清測定補體總溶血活性（CH50）。

2.5 受體大鼠外周血異種抗體IgM檢測小鼠→大鼠模型每組于術后1 d，豚鼠→大鼠模型每組于術后5 min，及排斥發(fā)生時，獲得各組受體大鼠血清。以血清中抗小鼠或抗豚鼠異種抗體為第一抗體，分別與正常小鼠或豚鼠心臟單細胞懸液混合，加入FITC標記小鼠抗大鼠IgM抗體各100 μL作為第二抗體，經(jīng)流式細胞儀，分別檢測受體大鼠血清抗小鼠及抗豚鼠異種抗體IgM濃度。

2.7 病理檢測排斥發(fā)生后，摘取小鼠和豚鼠移植供心送HE病理檢測。并觀察移植物中浸潤細胞種類，分別記數(shù)每張切片在400倍高倍視野下100目網(wǎng)格內多形核細胞和單核細胞數(shù)量，計算平均值進行統(tǒng)計分析。

2.8 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包處理。均值±標準差表示為(±s)。多個計量資料間比較采用F檢驗，計量資料兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠對大鼠及豚鼠對大鼠異種移植后各組供心存活時間比較對于小鼠對大鼠模型，4組在加用PGE1后，供心存活時間較2、3組進一步延長（P＜0.05），但3組CCV劑量加倍后，與2組比較效果不顯著（P＞0.05）。對于豚鼠對大鼠模型，各組間均存在顯著性差異（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠對大鼠及豚鼠對大鼠異種心臟移植術后各組供心存活時間±s)

表2 小鼠對大鼠及豚鼠對大鼠異種心臟移植術后各組供心存活時間±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CCV、CTX、FK506組比較，#P＜0.05

組別對照組CCV、CTX、FK506組CCV（加倍劑量）、CTX、FK506組CCV、CTX、FK506組、PGE1組豚鼠供心平均存活時間（h) 0.24±0.06 10.33±6.77*27.33±8.50*#18.67±4.08*#n6 6 6 6小鼠供心平均存活時間（d) 2.25±0.52 4.25±1.25*3.75±0.65 6.92±2.46*#

3.2 受體大鼠血清補體總溶血活性（CH50）測定

用藥組（2、3、4組）給予CCV后，在移植早期（術后1 d或5 min），受體大鼠血清CH50明顯降低（P＜ 0.05），排斥發(fā)生時，小鼠對大鼠模型CH50已恢復正常（P＞0.05），而豚鼠對大鼠模型，CH50仍顯著低于1組對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 術后受體大鼠血清總補體活性（CH50）改變±s)

表3 術后受體大鼠血清總補體活性（CH50）改變±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與術后早期（第1 d或5 min）比較，#P＜0.05

組別對照組CCV、CTX、FK506組CCV（加倍劑量）CTX、FK506組CCV、CTX、FK506組、PGE1組小鼠對大鼠模型術后第1 d 30.07±4.99 3.76±2.14*1.23±1.55*14.38±2.19*排斥時33.34±3.23 34.55±3.01#29.34±7.76#35.12±1.19#豚鼠對大鼠模型術后5 min 33.71±4.24 2.55±0.96*1.75±0.83*2.26±1.42*排斥時31.50±8.80 3.57±3.72*2.45±2.16*4.78±1.86*#

3.3 受體大鼠外周血異種抗體IgM檢測在小鼠對大鼠模型中，發(fā)生排斥時對照組抗小鼠IgM與術后1 d比較存在顯著性差異（P＜0.05），而用藥組（2、3、4組）術后1 d抗小鼠IgM明顯降低（P＜0.05），此后緩慢回升，至排斥發(fā)生時，仍低于對照組（P＜ 0.05）。在豚鼠對大鼠模型中，對照組排斥在短時間內發(fā)生，出現(xiàn)抗豚鼠IgM明顯降低（P＜0.05），而用藥組（2、3、4組）術后5 min可檢測到抗豚鼠IgM明顯降低（P＜0.05），至排斥發(fā)生時又明顯回升（P＜0.05），但仍顯著低于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 術后受體大鼠血清異種抗體IgM改變±s)

表4 術后受體大鼠血清異種抗體IgM改變±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與術后早期（第1 d或5 min）比較，#P＜0.05

組別對照組CCV、CTX、FK506組CCV（加倍劑量）CTX、FK506組CCV、CTX、FK506組、PGE1組抗小鼠異種抗體IgM術后第1 d 10.99±5.38 5.36±0.82*6.36±0.73*6.67±2.38*排斥時43.56±23.79#18.16±6.97*#15.36±2.75*#39.29±27.85#抗豚鼠異種抗體IgM術后5 min 88.29±7.49 14.72±4.45*12.16±5.88*16.86±9.37*排斥時70.64±11.91#45.22±26.08*#58.54±24.46*#44.71±18.16*#

3.5 病理檢測結果排斥發(fā)生時，HE染色切片光鏡下顯示，對照組小鼠心肌間質明顯充血、水腫，毛細血管內血栓形成，局部可見梗死區(qū)域，大量多形核細胞和單核細胞浸潤；給藥組隨存活時間延長，可見心肌梗死區(qū)域擴大，纖維組織增生，單核細胞浸潤增多。對于豚鼠供心，對照組心肌間質可見明顯充血、水腫，大量紅細胞滲出，甚至將心肌纖維分割。毛細血管內淤血、血栓形成。梗死區(qū)少見，給藥后隨存活時間延長，可見多形核細胞和單核細胞浸潤。表6顯示，無論小鼠或豚鼠供心，給藥后，隨供心存活時間延長，多形核細胞浸潤明顯減少（P＜0.05），而單核細胞浸潤明顯增加（P＜0.05）。

表5 排斥發(fā)生時受體大鼠外周血T淋巴細胞改變±s)

表5 排斥發(fā)生時受體大鼠外周血T淋巴細胞改變±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組CCV、CTX、FK506組CCV(加倍劑量)、CTX、FK506組CCV、CTX、FK506、PGE1組小鼠對大鼠模型CD4+T細胞0.86±0.09 0.65±0.19*0.61±0.24*0.73±0.09*CD8+T細胞0.19±0.10 0.41±0.16*0.43±0.19*0.45±0.25*豚鼠對大鼠模型CD4+T細胞0.79±0.03 0.76±0.05 0.56±0.13*0.69±0.10*CD8+T細胞0.17±0.03 0.23±0.06 0.44±0.05*0.32±0.06*

表6 小鼠及豚鼠移植供心排斥時多形核細胞及單核細胞浸潤程度±s)

表6 小鼠及豚鼠移植供心排斥時多形核細胞及單核細胞浸潤程度±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組CCV、CTX、FK506組CCV(加倍劑量)、CTX、K506組CCV、CTX、FK506、PGE1組小鼠供心多形核細胞12.50±4.61 4.85±5.41*4.93±5.22*4.25±3.06*單核細胞12.27±2.29 8.75±5.15 8.36±4.38 55.55±21.44*豚鼠供心多形核細胞3.28±3.33 2.98±2.10 1.12±0.76*1.50±0.58*單核細胞4.80±1.56 8.57±2.76*12.31±3.19*9.35±1.47*

4 討論

異種移植多沿用Calne在1970年提出的分類方法[2]，即根據(jù)超急性排斥反應（hyperacute rejection，HAR）發(fā)生的時間不同，分為移植后迅速發(fā)生排斥反應的非協(xié)調性異種移植，如豚鼠對大鼠的移植，以及將在移植后2～3 d內發(fā)生免疫排斥反應的協(xié)調性異種移植，如小鼠對大鼠的移植。本實驗豚鼠對大鼠異種心臟移植模型，對照組在不給藥的情況下，豚鼠供心的平均存活時間為0.24 h，而在小鼠對大鼠模型中，對照組小鼠供心平均存活時間為2.25 d，但豚鼠及小鼠供心均顯示出典型的超急性排斥病理改變。

異種移植雖然從理論上講具有廣闊的應用前景，但是其復雜的免疫排斥反應又制約了它的發(fā)展[3]。目前的研究認為，異種移植的HAR主要是由體液免疫介導的免疫反應。由于在受體動物血清中預先存在著的“天然抗體IgM”，可與移植物血管內皮細胞表面的異種α1,3-Gal抗原結合，激活受者的補體系統(tǒng)，攻擊移植物血管內皮細胞，從而引發(fā)HAR[4]。因此，異種抗體、補體、移植物血管內皮細胞被稱為異種移植的三大免疫學屏障。而且HAR被克服后，還會出現(xiàn)更為復雜的急性血管排斥反應（acute vascular rejection,AVR），其機理至今存在著爭論[5-6]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠供心的排斥過程中，異種抗小鼠IgM抗體處于一個顯著上升的狀態(tài)，且給藥組（2、3、4組）受體大鼠血清異種抗小鼠IgM明顯降低，移植物存活時間延長。而在豚鼠對大鼠模型中，不給藥的情況下對照組由于供心在平均0.24 h內被排斥，異種抗豚鼠抗體出現(xiàn)短暫的明顯下降，給藥后，豚鼠供心存活時間延長，其異種抗豚鼠IgM抗體變化趨勢與小鼠對大鼠模型一致。說明異種抗體IgM在異種HAR中起著重要的作用，應用環(huán)磷酰胺類藥物抑制異種抗體產生，可以減緩異種HAR的發(fā)生。實驗數(shù)據(jù)同時顯示，受體大鼠正常狀態(tài)下血清中抗小鼠異種抗體IgM的水平較低（10.99±5.38），而卻含有較高滴度的抗豚鼠異種抗體IgM（88.29± 7.49），說明親緣關系較遠的種屬之間可能存在較高滴度的異種抗體IgM，而HAR的發(fā)生強度、速度與異種抗體IgM的滴度間可能存在一定的相關性。

補體在異種移植后發(fā)生的HAR中起重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，非協(xié)調性異種移植后，受體血清補體含量明顯下降，在移植物細胞表面可觀察到各類補體成分的沉著，應用眼睛蛇毒因子或其他補體抑制劑可延緩HAR的發(fā)生，而中華眼鏡蛇毒因子是我國特有的蛇毒提取藥物，已有文獻報道其消耗補體作用優(yōu)于國外產品[7-8]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，在小鼠對大鼠的協(xié)調性異種移植中，給予補體抑制劑CCV可以明顯降低補體水平，延長移植物存活時間，而且當供心停跳時補體均恢復至原有的高水平狀態(tài)。而在豚鼠對大鼠模型中，供心停跳時補體水平雖有回升，但仍然較低，尤其3組在應用了加倍劑量的CCV后，使補體水平進一步降低，供心存活時間得到進一步延長（27.33 h），小鼠對大鼠模型的3組中卻并無此改變。說明補體參與了異種移植術后HAR的過程，但協(xié)調性異種移植排斥可能需高補體活性參與作用，而非協(xié)調性異種移植中僅需低活性的補體即可將供心排斥。

當異種移植的HAR得到控制，供心存活時間延長，即進入AVR階段。本實驗在兩類模型的給藥組中均出現(xiàn)AVR的改變。其特征為移植物血管內皮細胞嚴重的損傷及彌漫性血管內凝血、單核細胞浸潤，病理改變與同種異體移植的急性血管排斥反應非常相似[9-10]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，在小鼠移植供心中，對照組在發(fā)生HAR的移植物中即可見多形核及單核細胞浸潤，此時受體大鼠外周血CD4+T細胞比例明顯增高，用藥后隨供心存活時間延長單核細胞浸潤進一步增多，而多形核細胞呈逐漸減少的趨勢，外周血CD4+T細胞接近正常水平，而CD8+T細胞明顯增殖。表明在AVR中單核吞噬細胞系統(tǒng)成為免疫排斥的重要組成部分。而在豚鼠供心中細胞浸潤現(xiàn)象明顯少于小鼠供心，但隨時間延長，外周血CD8+T細胞增殖增高，移植物單核細胞浸潤也呈逐漸增多趨勢。PGE1可抑制血液凝固、穩(wěn)定血管內皮細胞、并抑制T細胞毒效應，加入PGE1使小鼠供心存活時間進一步延長，說明其對AVR的抑制作用。上述數(shù)據(jù)一方面說明非協(xié)調性異種移植的HAR更加急劇，另一方面也說明AVR與HAR并不是截然分開的兩個過程，它們沒有絕對的時間限制。目前關于同種或異種移植AVR的機制仍然存在爭論，但越來越多的證據(jù)表明異種抗體與移植物血管內皮細胞的結合，也許還包括補體的作用，最終導致內皮細胞的激活。激活的內皮細胞通透性增加、釋放細胞因子促進血液凝固和炎癥的發(fā)展，使移植物出現(xiàn)血栓形成、缺血等病理改變。此外，NK細胞和其它炎癥細胞、以及參與凝血系統(tǒng)的分子的不匹配等因素，也參與了AVR的發(fā)生發(fā)展過程[11]。

本實驗表明，非協(xié)調性異種移植后將發(fā)生更為嚴重的HAR，其中補體活性、異種抗體IgM滴度都可能起著重要的作用。而且異種移植后的HAR和 AVR并不是截然分開的兩個過程，存在著密切的相互關聯(lián)，是整個排斥過程中具有不同特點的兩個階段。針對異種排斥的特點，聯(lián)合應用多種免疫抑制藥物，尤其是加用中華眼鏡蛇毒因子，才可能取得較好的治療效果。CCV、CTX、FK506、PGE1組合對協(xié)調性異種移植較為適用，對非協(xié)調性異種移植，應進一步加大CCV用量，增加對補體的抑制。

[1]Heron I.A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats[J].Acta Pathol Microbiol Scand,1971,79(4): 366.

[2]Calne RY.Organ transplantation between widely disparate species [J].Transplant Proc,1970,2(1):550.

[3]Zhong R.Gal knockout and beyond[J].Am J Transplant,2007,7 (1):5.

[4]Baumann BC,Stussi G,Huggel K,et al.Reactivity of human natu?ral antibodies to endothelial cells from Galalpha(1,3)Gal-deficient pigs[J].Transplantation,2007,83(2):193.

[5]Hosiawa KA,Wang H,DeVries ME,et al.CD80∕CD86 costimula?tion regulates acute vascular rejection[J].J Immunol,2005,175(9): 6197.

[6]Wang H,Hosiawa KA,Garcia B,et al.Treatment with a short course of LF 15-0195 and continuous cyclosporin A attenuates acute xenograft rejection in a rat to mouse cardiac transplantation model[J].Xenotransplantation,2003,10(4):325.

[7]Chen G,Sun QY,Wang XM,et al.Improved suppression of circu?lating complement does not block acute vascular rejection of pig-to-rhesus monkey cardiac transplants[J].Xenotransplanta?tion,2004,11(2):123.

[8]Li R,Chen G,Guo H,et al.Prolonged cardiac allograft survival in presensitized rats after a high activity Yunnan-cobra venom factor therapy[J].Transplant Proc,2006,38(10):3263.

[9]Ghanekar A,Mendicino M,Liu H,et al.Endothelial Induction of fgl2 Contributes to Thrombosis during Acute Vascular Xenograft Rejection[J].The Journal of Immunology,2004,172(9):5693.

[10]Ginesta MM,Ribas Y,Mollevi DG.,et al.Acute xenograft rejec?tion,late xenograft rejection and long term survival xenografts in the hamster-to-rat heart transplantation model:histological charac?terisation under low-dose of FK506[J].APMIS,2002,110(10):737.

[11]Parker W,Lin SS,Platt JL.Antigen Expression in Xenotransplan?tation:How Low Must It Go?[J].Transplantation,2001,71(2):313.

（收稿：2010-02-20修回：2010-06-10）

（責任編輯劉洪斌田在善）

Research on Function of Integrated Chinese Cobra Venom and Immune Suppressive Drugs on Immune Rejection in Xenotransplantation

Qi Feng,Zhu Liwei,He Xianghui,et al.Department of General Surgery,

Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin(300052），China

ObjectiveTo study the immune mechanism of concordant and discordant xenotransplantation and methods of controlling immune rejection by combined Chinese Cobra Venom and other immune suppressive drugs.MethodsThe mouse to rat and the guinea pig to rat heterotopic cardiac xenotransplantation models were established by improved Heron’s cuff technique in neck,which were divided into 4 groups respectively as following:Group 1

xenograft without treatment;Group 2 was treated with CCV,CTX,and FK506;The dose of CCV in Group 3 was doubled;Group 4 was treated with CCV,CTX,FK506,and PGE1.ResultsThe cardiac survival time of Group 2,3,4 increased obviously,especially for Group 4 of mouse to rat model with PGE1 treatment(6.92 days)and for Group3 of guinea pig to rat model with double-dosed CCV(27.33hrs).In both of the models,the levels of CH50 and xeno-IgM decreased after treatment and acute vascular rejection(AVR) gradually happened.ConclusionThe HAR and AVR in xenotransplantation are closely related and inter?laced without limit.Chinese Cobra Venom combined with other immune suppressive drugs can be effective in xenotransplantation,especially for discordant xenotransplantation.

xenotransplantation,cardiac,hyperacute rejection(HAR),acute vascular rejection(AVR),Chi?nese cobra venom(CCV)

R617;R541

A

1007-6948(2010)04-0448-05

10.3969∕j.issn.1007-6948.2010.04.018

國家自然科學基金資助項目（30500489）

國家自然科學基金資助項目（30940066）

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院普通外科（天津300052）

戚峰，E-mail：qf@medmail.com.cn