凌暉 朱亞平 劉芳 李艷蘭 文玲 蘇琦

南華大學(xué)腫瘤研究所，病理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001

生物體內(nèi)存在復(fù)雜的細胞周期檢測點信號網(wǎng)絡(luò)途徑，由感受器（Rad9-Rad1-Hus1復(fù)合體、Rad17等）、信號傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器［細胞周期檢測點激酶（checkpoint kinase，Chk，如Chk1、Chk2等）］等構(gòu)成［1］。Chk1是生物進化過程中非常保守的一種蛋白激酶，在細胞周期檢測點調(diào)節(jié)中有著非常重要的作用，其在人體多種正常組織和腫瘤組織中均有表達，并可能與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2］。研究表明，Chk1缺失的腫瘤細胞表現(xiàn)出多重缺陷如：細胞增殖緩慢、細胞周期檢測點的阻滯反應(yīng)消失和對DNA損傷劑的敏感性增加等［3-4］。由于細胞周期與腫瘤間的密切關(guān)系，Chk1與腫瘤的關(guān)系及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用也成為目前研究的熱點之一。為探索Chk1在人類腫瘤細胞中對生長增殖活性和細胞周期的調(diào)控作用，本研究通過RNA干擾技術(shù)將人胃癌BGC823細胞中的Chk1基因沉默，阻斷細胞周期檢查點信號傳導(dǎo)通路，觀察其對人胃癌BGC823細胞生長及周期的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液及Chk1 siRNA（基因序列為5’-AAGTTCAACTTGCTGTGAATA-3’）、LipofectamineTM2000為Santa Cruz公司產(chǎn)品。Bradford試劑購于上海生功生物工程有限公司。Chk1（兔抗人多克隆抗體）及相應(yīng)二抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。β-actin購自武漢博士德公司（兔抗人多克隆抗體）。電化學(xué)發(fā)光劑Lumi-GLO Reagant是CST公司產(chǎn)品。碘化丙啶（PI）購自Sigma公司。

1.2 BGC823細胞的培養(yǎng) 人胃癌BGC823細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞研究所，系人胃低分化腺癌。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、恒濕、恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 RNA干擾實驗 siRNA的配制及脂質(zhì)體復(fù)合體合成：5 nmol的Chk1 siRNA用無核酸酶水稀釋，終濃度為20 μmol/L。將干擾用的適量siRNA稀釋于siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液中，輕輕混勻。適量的LipofectamineTM2000與稀釋的siRNAs混合，輕輕混勻，并于室溫下溫育20 min左右，制備獲得siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合體。

siRNA轉(zhuǎn)染細胞：轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的細胞以3×105個/孔接種于6孔板中，細胞鋪板在2 mL含血清、不含抗生素的正常培養(yǎng)基中，于24 h內(nèi)當細胞融合達40%～60%時進行轉(zhuǎn)染，在加入復(fù)合物前換用1 mL無血清、無抗生素的培養(yǎng)液后將脂質(zhì)體復(fù)合體加到培養(yǎng)板中，按轉(zhuǎn)染試劑說明書分別予50、100、150 μmol/L的Chk1 siRNA進行轉(zhuǎn)染。置37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮的含血清、不含抗生素的正常培養(yǎng)液2.5 mL，實驗分為未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染組3組，其中未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組作為對照。

1.4 Western blot檢測 細胞裂解，收集蛋白質(zhì)，Bradford法測定含量。蛋白變性后每孔上樣30 μg，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST（Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L和0.1%Tween-20）室溫封閉1 h，用Chk1、β-actin 4 ℃過夜，TBST洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗室溫溫育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層色譜掃描儀（日本公司生產(chǎn)，型號CS-930）測定印跡區(qū)帶的灰度值。

1.5 MTT實驗 MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthi ahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍色（或藍紫色）不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的多少可以用酶標儀在570 nm處進行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度A值推測出活細胞的數(shù)目。由于死細胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會有反應(yīng)。本實驗常規(guī)胰酶消化后收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，制成單細胞懸液，細胞密度為1×105個，接種100 μL于96孔平底培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后加入20 μL 5 mg/mL MTT/PBS液培養(yǎng)6 h即終止培養(yǎng)，以DMSO溶解甲簪，振搖10 min，置酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長570處的A值（取6復(fù)孔）。抑制率（inhibition rate，IR）按公式計算： IR（%）=（1-A570實驗組/A570對照組）×100%

1.6 流式細胞儀分析 收集轉(zhuǎn)染24和48 h的培養(yǎng)細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇溶液固定48 h，1 000×g離心10 min，棄上清液，1 000 μL PBS重懸加0.5 mg/mL RNase50 μL，混勻，37 ℃水浴30 min，PBS洗去RNase，100 μL PBS重懸，加1 mg/mL碘化丙啶（PI）50 μL，振蕩混勻，4 ℃避光染色30 min。流式細胞儀測定熒光強度，CellQuest分析軟件進行細胞周期DNA含量分析，確定細胞周期分布。

1.7 統(tǒng)計處理 采用SPSS 11.5.2.1統(tǒng)計分析軟件，進行Student’s t-test法分析，數(shù)值用表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染后Chk1在BGC823細胞的表達 Western blot測結(jié)果顯示（圖1），轉(zhuǎn)染靶向Chk1 siRNA 24 h的Chk1蛋白雜交帶，其相對灰度值為0.11±0.08，明顯低于未轉(zhuǎn)染組的0.66±0.21、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的0.70±0.25（P<0.05），而未轉(zhuǎn)染對照組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Chk1的蛋白表達下調(diào)了83.1%。這證實了轉(zhuǎn)染靶向Chk1 siRNA抑制Chk1蛋白的表達。

2.2 Chk1siRNA轉(zhuǎn)染后對細胞增殖的影響在確保Chk1基因被有效沉默后，本研究針對Chk1蛋白表達缺失情況下的細胞，采取MTT法檢測其增殖活性的變化。對siChk1轉(zhuǎn)染48 h的BGC823細胞進行MTT 檢測。相比未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，Chk1基因沉默后的BGC823細胞增殖活性明顯下降，生長受到抑制。細胞增殖活性在100 μmol/L轉(zhuǎn)染后48 h 其吸光度（A570）為0.41±0.04，明顯低于為未轉(zhuǎn)染組的0.79±0.05和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的0.82±0.07（P<0.05）（表1）。50 μmol/L siChk1對細胞生長有一定抑制作用，隨濃度增加抑制率也增加，100 μmol/L時抑制率為48.1%，100、150 μmol/L濃度組對細胞的抑制率無明顯差異。這些發(fā)現(xiàn)揭示一定水平的Chk1蛋白的表達是腫瘤細胞進行增殖活動所必需的。

表1 100 μmol/L siChk1轉(zhuǎn)染后BGC823細胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

表1 100 μmol/L siChk1轉(zhuǎn)染后BGC823細胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected control.

2.3 Chk1siRNA轉(zhuǎn)染后對細胞周期的影響 為了進一步探討這種細胞生長變緩是否與細胞周期的改變有關(guān)，本研究采用了流式細胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）的方法，檢測了Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞處于不同時期的比例變化，對siChk1轉(zhuǎn)染24、48 h后的細胞進行細胞周期分析，與未轉(zhuǎn)染組相比，經(jīng)過Chk1 siRNA作用后細胞比例在G0/G1期由未轉(zhuǎn)染組的（48.3±1.1）%、（50.2±1.9）%增加至（63.9±1.7）%、（66.1±2.3）%（P<0.05），S期和G2/M期減少，增殖指數(shù)（proliferating index，PI）由51.7%和49.8%減少至36.2%和34.4%（表2，圖2）。

圖1 Chk1 SiRNA轉(zhuǎn)染BGC823細胞后Chk1蛋白表達的改變Fig.1 Expressions of Chk1 protein in BGC823 cells after transfection with Chk1 siRNA

圖2 Chk1 siRNA干擾對BGC823細胞周期的影響Fig.2 The effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells

表2 Chk1 siRNA干擾前后BGC823細胞周期的變化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

表2 Chk1 siRNA干擾前后BGC823細胞周期的變化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected group.

3 討 論

腫瘤發(fā)生的根本原因在于本應(yīng)停止增殖或生理性凋亡的細胞不停地進入細胞周期，從而導(dǎo)致細胞的惡性增殖。細胞通過調(diào)控cyclin、CDK、CKI和Chk1等基因的有序表達實現(xiàn)對細胞周期進展速度的調(diào)控［5］。檢查點激酶Chk1是非常重要的細胞周期檢測點調(diào)節(jié)蛋白，其蛋白的穩(wěn)定表達有利于維護DNA損傷修復(fù)和細胞周期檢測點調(diào)節(jié)，以保證細胞基因組的完整和穩(wěn)定［1］。在臨床上由于腫瘤細胞在化療中逃避凋亡，許多通過損傷DNA使細胞凋亡的癌癥治療方案在療效上十分有限， 而細胞逃避凋亡與細胞周期檢查點的活化有關(guān)，因而有研究者試圖通過抑制細胞周期檢測點來增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，Chk1的研究為癌癥的治療帶來了契機［6-8］。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使胃癌細胞株BGC823的Chk1基因沉默，旨在探討抑制細胞周期檢測點激酶Chk1對人胃癌細胞株BGC823增殖與細胞周期的影響。

本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)觀察了Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染對BGC823細胞Chk1表達的影響，結(jié)果顯示，將Chk1基因沉默后，通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)細胞中Chk1蛋白水下降明顯，表明靶向Chk1 siRNA產(chǎn)生了序列特異性效果。在確保Chk1基因被有效沉默后，本研究針對Chk1蛋白表達缺失情況下的細胞，采取MTT法評價其增殖活性的變化。結(jié)果顯示，相比未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，Chk1基因沉默后的BGC823細胞增殖活性明顯下降，生長受到抑制。這些發(fā)現(xiàn)揭示一定水平的Chk1蛋白的表達是腫瘤細胞進行增殖活動所必需的。本研究還發(fā)現(xiàn)，Chk1 siRNA沉默目的基因?qū)毎芷诋a(chǎn)生了顯著影響，使細胞周期阻滯在G0/G1期。Chk1表達的下調(diào)影響細胞增殖，其機制可能與G0/G1期阻滯作用相關(guān)。

Chkl參與G1/S檢測點調(diào)控，G1/S 檢測點阻止細胞進入S狀態(tài)，當DNA受到損害不能進行復(fù)制時這種阻止就開始發(fā)生，為了適應(yīng) DNA的損害，G0/G1阻滯作用通過Chk1路徑快速地發(fā)生［9］。本研究結(jié)果證實，Chk1表達下調(diào)可能通過誘導(dǎo)G0/G1期阻滯來抑制人胃癌BGC823細胞增殖，其具體分子機制有待于進一步研究。

綜上所述，Chk1對人胃癌細胞生長和增殖起著重要的調(diào)控作用。Chk1基因沉默導(dǎo)致細胞增殖活性顯著下降，細胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，生長受抑。揭示Chk1蛋白可能直接或間接地參與細胞周期進程的調(diào)控。

［1］ Choi JH, Lindsey-Boltz LA, Sancar A. Reconstitution of a human ATR-mediated checkpoint response to damaged DNA［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104 (33): 13301-13306.

［2］ Herman-Antosiewicz A, Stan SD, Hahm ER, et al. Activation of a novel ataxia- telangiectasia mutated and Rad3 related/checkpoint kinase 1-dependent prometaphase checkpoint in cancer cells by diallyl trisulfide, apromising cancer chemop reventive constituent of p rocessed garlic［J］. Mol Cancer Ther, 2007, 6 (4): 1249-1261.

［3］ Zachos G, Black EJ, Walker M, et al. Chk1 is required for sp indle checkpoint function［J］. Dev Cell, 2007, 12(2): 247-260.

［4］ 李昌軍, 劉凱于, 楊東葉, 等. 檢驗點激酶1的研究進展［J］. 細胞生物學(xué)雜志, 2006, 28(2): 149-152.

［5］ Reinhardt HC, Yaffe MB. Kinases that control the cell cycle in response to DNA damage: Chk1, Chk2 and MK2［J］. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(2): 245-255.

［6］ Janetka JW, Ashwell S. Checkpoint kinase inhibitors: a review of the patent literature［J］. Expert Opin Ther Pat, 2009,19(2): 165-197.

［7］ Jia XZ, Yang SY, Zhou J, et al. Inhibition of CHK1 kinase by G?6976 converts 8-chloro-adenosine-induced G2/M arrest into S arrest in human myelocytic leukemia K562 cells［J］.Biochem Pharmacol, 2009, 77(5): 770-808.

［8］ 黃偉, 張瑤珍, 周劍鋒, 等. Chk1/2反義寡核苷酸對順鉑作用下K562細胞凋亡的影響［J］.中國實驗血液學(xué)雜志,2004, 12(5): 563-567.

［9］ Massague J. G1cell-cycle control and cancer［J］. Nature,2004, 432 (7015): 298-306.