陳佳艷 綜述 樊旼 審校

復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放射治療科，復(fù)旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其中80%～85%的病例為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）。據(jù)統(tǒng)計，在歐洲，每年肺癌新發(fā)病例超過20萬，因其死亡的人數(shù)占所有癌癥相關(guān)死亡的20%。在美國，每年約有15萬患者死于肺癌［1-3］。在中國大陸，肺癌的發(fā)病率和病死率均呈顯著升高的趨勢。據(jù)2008年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計，肺癌相關(guān)死亡率居惡性腫瘤總死亡率的首位，為30.83/10萬。在男女惡性腫瘤相關(guān)死亡中，肺癌均為最主要原因［4］。

手術(shù)、放療和化療一直都是NSCLC的主要治療方法。隨著對腫瘤發(fā)病機制及其生物學行為研究的不斷深入，人們越來越多的把焦點聚向了以特異性高、不良反應(yīng)輕為特點的分子靶向治療。近幾年來，在肺癌的分子靶向治療領(lǐng)域，研究熱點一直集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶點上，涌現(xiàn)出許多針對這些靶點的分子靶向藥物。臨床實踐證明并非所有患者都能從中獲益，NSCLC各組織類型間存在分子靶向藥物療效上的差異。例如多項臨床試驗結(jié)果均證實腺癌為EGFR-TKI的優(yōu)勢人群。然而即便同樣身為腺癌患者，使用EGFR-TKI后有些可以獲得疾病的長期緩解，有些會在TKI初始有效后出現(xiàn)獲得性耐藥，還有一些患者則原發(fā)性耐藥。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在原有突變基礎(chǔ)上，EGFR 20號外顯子上C-T堿基置換后導(dǎo)致的T790M的錯義突變，MET癌基因的擴增與EGFR-TKI獲得性耐藥有關(guān)［5］，K-ras基因突變則是產(chǎn)生原發(fā)耐藥的相關(guān)機制之一［6］。近期發(fā)現(xiàn)的EML4-ALK融合基因，其與EGFR突變，K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有該基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點是肺腺癌特異性較高的分子標記物，并且很有可能是繼T790M、K-ras之后EGFR-TKI耐藥的又一重要機制，因此備受關(guān)注。

1 EML4-ALK基因的發(fā)現(xiàn)

2007年Soda等［7］在1例62歲的吸煙肺腺癌患者手術(shù)切除的標本中，擴增出一個由3 926 bp組成的DNA片段，可以編碼一個由1 059個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白的氨基端（殘基1-496）是人類EML4編碼蛋白（基因庫編號NM-019063）的一部分，而羧基端（殘基497-1059）則由人類ALK（基因庫編號 AB209477）編碼蛋白的一部分構(gòu)成，研究人員從中得到啟發(fā)，編碼這一蛋白的基因很有可能是EML4和ALK融合基因。

EML4屬于棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族，由N末端堿基區(qū)，疏水的棘皮動物微管相關(guān)蛋白區(qū)（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）以及WD重復(fù)區(qū)3部分構(gòu)成。在EML4-ALK融合基因中，與ALK的胞內(nèi)近胞膜部分發(fā)生融合的是EML4的部分N末端堿基、HELP和部分WD重復(fù)區(qū)［8-10］。

ALK于1994年首先發(fā)現(xiàn)于間變性大細胞淋巴瘤AMS3細胞株中［11］，是由1 620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族［12］。該蛋白由膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域組成，下游信號通路為Ras-ERK，JAK3-STAT3，以及PI3-K/Akt等，這些通路與細胞增殖、存活、遷移密切相關(guān)［13-14］。

2 EML4-ALK基因的體外轉(zhuǎn)化致瘤活性

EML4-ALK融合基因的重排發(fā)生在2號染色體短臂上的2區(qū)1帶和2區(qū)3帶。Soda等［7］通過測序得出，EML4的13號外顯子上斷裂產(chǎn)生的3.6 kb大小的片段插入并連接上ALK的20號外顯子的一個297 bp大小的片段，共同構(gòu)成了融合基因（1型）。在這一研究的基礎(chǔ)上，2008年研究人員把轉(zhuǎn)染了融合基因的小鼠3T3成纖維細胞接種在裸鼠身上，建立了表達EML4-ALK融合基因的肺癌的轉(zhuǎn)基因動物模型（小鼠），發(fā)現(xiàn)在小鼠肺部腫瘤發(fā)生的全過程中，EML4-ALK基因均發(fā)揮著重要作用，進一步在體外證實了該融合基因的轉(zhuǎn)化致瘤活性。同時，他們發(fā)現(xiàn)EML4 N末端的堿基區(qū)域?qū)τ谄渲铝龌钚宰顬殛P(guān)鍵，可能與其在EML4-ALK基因聚合過程中發(fā)揮重要作用有關(guān)［15］。

3 EML4-ALK基因與NSCLC

Soda等［7］在隨后的研究中，應(yīng)用RT-PCR的方法對于75例NSCLC患者的組織標本進行了EML4-ALK融合基因、EGFR18、19、20號外顯子突變，以及K-ras突變的檢測，發(fā)現(xiàn)5例患者存在EML4-ALK 1型融合基因（3例腺癌，2例鱗癌），同時發(fā)現(xiàn)該基因陽性的患者與EGFR以及K-ras突變陽性的患者沒有重疊。并且，在繼續(xù)檢測了261例包括非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、胃腸道腫瘤在內(nèi)的其他惡性腫瘤的EML4-ALK融合基因后，均未發(fā)現(xiàn)含有該基因。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)了EML4在20號外顯子附近斷裂后與ALK進行融合的第2種亞型（2型）。最終，研究者得出結(jié)論，該融合基因很有可能是NSCLC特有的一個新型基因靶點。在檢測方法上，RT-PCR是一種較為敏感的方法，可以在很少DNA拷貝數(shù)的情況下，甚至是在只有極少數(shù)EML4-ALK陽性細胞的痰液中，檢測出融合基因的存在。

同年，Inamura等［16］使用RT-PCR的方法檢測221例包含了腺癌、鱗癌、大細胞癌以及小細胞癌在內(nèi)的肺癌患者EML4-ALK融合基因的mRNA情況，對于檢測陽性的患者，進一步使用免疫組化的方法觀察融合基因的表達。結(jié)果只在腺癌這一組織類型中檢測到5例患者（3.4%）有融合基因的mRNA并均在細胞質(zhì)中用免疫組化檢測到ALK融合蛋白。

上述2項研究均來自日本，隨后在1項來自歐美的多中心參與的研究中，Perner等［17］使用FISH方法檢測600例NSCLC患者EML4-ALK基因情況，發(fā)現(xiàn)融合基因的發(fā)生率小于Soda報道的6.7%以及Kentaro 報道的3.4%，只有2.7%。并且在檢測出融合基因的腫瘤中，并不是所有的腫瘤細胞均含有該融合基因。發(fā)生率的差異，可能與人種不同有關(guān)。研究人員因為僅僅在1例患者中證實融合基因為基因重排導(dǎo)致，由此認為就其機制而言，存在著比Soda等報道的簡單插入更為復(fù)雜的，導(dǎo)致EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的基因水平的改變。

由于早先研究淋巴瘤ALK融合基因類型的過程中，發(fā)現(xiàn)除了人們熟知的NPM-ALK之外還有10多種其他的融合方式，與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。那么在NSCLC中，是否也存在除了EML4-ALK融合基因以外的其他類型的ALK融合基因，也有學者就此展開研究。Rikova等［18］的實驗中，研究了41種NSCLC細胞株以及150例NSCLC腫瘤標本中磷酸化的酪氨酸相關(guān)的多個靶點，ALK相關(guān)融合基因除了3例為EML4-ALK外，還有1例為TFG-ALK融合基因。但在2008年Shinmura等［19］的研究中，使用RT-PCR以及測序檢測的77例NSCLC患者，除了2例腺癌患者檢測到EML4-ALK（2.6%，1型融合體和2型融合體各1例）外，并沒有發(fā)現(xiàn)含有NPM、TPM3、CLTC、ATIC和TFG-ALK的其他ALK相關(guān)的融合基因。

隨著研究的深入，研究人員還發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK融合基因的其他亞型，區(qū)別主要在于EML4發(fā)生截斷的位點不同。Choi等［20］報道了EML4的6號外顯子附近與ALK 20號外顯子銜接的亞型3。Takeuchi等［21］發(fā)現(xiàn)的EML4的14號外顯子和2號外顯子與ALK 20號外顯子結(jié)合的亞型4和亞型5以及后來發(fā)現(xiàn)的亞型6和亞型7［22］。

就EML4-ALK是否為NSCLC唯一特有的靶點這一問題，F(xiàn)ukuyoshi等［23］分別檢測了104例肺癌、555例胃腸道腫瘤、90例乳腺癌標本，僅1例肺癌標本中發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK的轉(zhuǎn)錄，在其余的腫瘤中均未發(fā)現(xiàn)該融合基因，研究者認為這樣的實驗結(jié)果強烈提示這一靶點很有可能為NSCLC所特有。但是緊接著2009年Lin等［24］發(fā)表在 Mol Cancer Res上的研究中，209例乳癌患者5例檢出該融合基因，83例結(jié)直腸癌患者2例檢出，106例NSCLC中有12例檢出，提示該融合基因也可能與包括肺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤相關(guān)，但仍以NSCLC中檢出率最高。

4 EML4-ALK陽性患者的臨床特征

有趣的是，隨著實驗數(shù)據(jù)的不斷積累，和最初Soda等［7］得出的結(jié)果相一致，EML4-ALK融合基因確實極少與常見于NSCLC的EGFR突變以及K-ras突變并存于同一組織標本。一組來自日本的數(shù)據(jù)中，Inamura等［25］檢測了363例肺癌組織樣本，11例腺癌中檢出融合基因，對于這11例標本，進一步研究其與EGFR、K-ras、TP53突變以及TTF-1的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)EML4-ALK陽性的腫瘤具有下列特征：腺泡來源，分化更差，極少伴有EGFR以及K-ras的突變，偶爾伴有TP53突變，多發(fā)生于不吸煙或輕度吸煙患者，經(jīng)常伴有TTF-1表達。香港大學的Wong等［26］對266例手術(shù)切除的原發(fā)性肺癌患者的標本進行了檢測，13例患者（4.9%）標本中檢出了融合基因，腺癌11例，腺鱗癌2例；同樣地，他們發(fā)現(xiàn)融合基因更易發(fā)生于不吸煙、年輕以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)合以上數(shù)據(jù)，2009年Shaw等［27］進行了更為細致的研究，他們以女性、亞裔、輕度或者不吸煙的腺癌中至少符合2項為標準，有選擇性地挑選了141例NSCLC，檢測了標本中的EML4-ALK、EGFR以及K-ras突變情況，共檢出了19例（13%）EML4-ALK，其中18例為腺癌，1例為腺鱗癌。發(fā)生上述3種突變的患者沒有重疊。與EGFR突變組以及EGFR、ALK突變均陰性的野生組相比，EML4-ALK陽性的患者更年輕，多為男性，輕度或者不吸煙。在有遠處轉(zhuǎn)移的患者中，該融合基因與EGFR TKI的抗拒性有關(guān)。

那么中國人群NSCLC患者中該融合基因的情況究竟如何。2009年Zhang等［28］使用RACEPCR為基礎(chǔ)的測序法共檢測了109例NSCLC標本，檢出12例陽性（11.01%），除外1、2、3、5亞型外，在3例腺癌患者中檢出了EML4 18號外顯子的亞型。所有EML4-ALK陽性患者均無K-ras突變，但是與以往研究不同的是，在1例女性腺癌中出現(xiàn)EML4-ALK與EGFR19號外顯子突變的并存。是否在中國NSCLC患者中有不一樣的情況，還需要進一步研究。關(guān)于EML4-ALK基因在NSCLC中檢出情況見表1。

表1 EML4-ALK在NSCLC中檢出情況Tab.1 Studies evaluating EML4-ALK positivity in NSCLC

5 針對EML4/ALK基因的抑制劑

任何一個腫瘤新靶點的發(fā)現(xiàn)，最后都著眼于設(shè)計出安全有效的藥物，在分子水平治療上腫瘤。1項歐美與韓國共同參與的多中心研究初步評價了針對EML4-ALK這一新型靶點的抑制劑。Koivunen等［29］使用RT-PCR以及外顯子序列分析的方法分析了305例NSCLC患者（美國138例，韓國167例）組織以及83個NSCLC細胞株，8例（3%）患者腫瘤中以及3個細胞株中（3.6%）檢出融合基因。在1例NSCLC細胞株體外、體內(nèi)實驗中，針對ALK的抑制劑TAE684體現(xiàn)了抑制ALK激酶活性、增加腫瘤細胞凋亡的作用。另外一種口服的AKT抑制劑（PF02341066）目前正在Ⅰ期臨床試驗中接受安全性和有效性的評估［30］。

綜上所述，EML4-ALK是NSCLC發(fā)生發(fā)展中獨立而又關(guān)鍵的分子靶點，主要發(fā)生于腺癌，EGFR、K-ras野生型，輕度吸煙/不吸煙，年輕男性患者?？赡苁荰790M、K-ras和MET之外另一潛在的EGFR-TKI耐藥機制之一。針對這一靶點的深入研究，將有助于篩選EGFRTKI合適的治療人群并開創(chuàng)EGFR-TKI耐藥的NSCLC靶向治療新領(lǐng)域。

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