王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及鑒定

王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 建立大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的組織塊貼壁法。方法 采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，胰酶消化法傳代，并應(yīng)用相差顯微鏡和平滑肌肌動(dòng)蛋白對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定。結(jié)果 90%的組織塊接種存活，培養(yǎng)5代的平滑肌細(xì)胞純度達(dá)98%以上。鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“峰-谷”狀生長，免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白陽性表達(dá)。結(jié)論 組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠平滑肌細(xì)胞操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、純度較高、存活率高。

平滑肌細(xì)胞；組織塊貼壁法；原代培養(yǎng)

血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的異常增殖、遷移、凋亡不足及細(xì)胞外基質(zhì)沉積造成的內(nèi)膜增生是動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄、移植血管病變的主要原因。動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行平滑肌細(xì)胞分子生物學(xué)研究的基本條件，可用于多種與平滑肌細(xì)胞生長、增殖有關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)理及藥物作用機(jī)制的研究，如動(dòng)脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）術(shù)后再狹窄、藥物的鈣通道開放（拮抗）作用、血管損傷引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。本研究在參照國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)[1～3]的基礎(chǔ)上，建立了一種簡便、易行的原代培養(yǎng)大鼠VSMC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠體重120～150g，雌雄不限，購自蘭州大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM（高糖型）培養(yǎng)基、胰蛋白酶粉、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清均購自HyClone公司。小鼠抗大鼠SM-actin單克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司（中國）。青霉素鈉、硫酸鏈霉素（華北制藥廠），24孔板，10mm×10mm蓋玻片，25cm2塑料培養(yǎng)瓶（Costar公司）及手術(shù)器材。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 原代培養(yǎng) SD大鼠斷頸處死，放血，75%乙醇浸泡5min，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，沿腹中線剖開胸腔、腹腔，剪開膈肌，翻開左側(cè)肺葉，可見在脊柱前走行的胸主動(dòng)脈。小心分離取出胸主動(dòng)脈，立即置于含青霉素100U/ml，濃度100mg/ml硫酸鏈霉素的無菌PBS液體中。用兩把眼科鑷輕輕夾住血管向相反方向稍用力牽拉，呈袖套樣剝除外膜。更換平皿，用PBS液漂洗2次后，縱向剖開血管，將血管內(nèi)膜面朝上平鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，以去除內(nèi)皮細(xì)胞。用眼科彎剪反復(fù)將其剪成1mm×1mm的組織塊，邊緣整齊、光滑，用彎頭吸管移入并均勻貼放于25cm2培養(yǎng)瓶底面，間隔約5mm，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶內(nèi)加入約4ml含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。然后瓶蓋旋松，于CO2培養(yǎng)箱中靜置4～6h，使組織塊干涸并與瓶底貼壁附著后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置于37℃的CO2孵箱中3～7d。待有細(xì)胞從組織塊周圍游出后換液，以后約2～3d換液1次。

1.2.2 細(xì)胞換液 細(xì)胞換液主要根據(jù)細(xì)胞生長狀況及培養(yǎng)液的顏色變化決定。當(dāng)細(xì)胞增殖旺盛，培養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)辄S色時(shí)，需換液。在超凈工作臺(tái)上，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗后，加入新鮮的含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，也可進(jìn)行半量或2/3量換液。換液時(shí)應(yīng)動(dòng)作輕柔，盡量不要碰到組織塊。

1.2.3 細(xì)胞傳代 至單層細(xì)胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%以上時(shí)即可進(jìn)行傳代。將原代細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液小心吸棄，加入PBS液2ml輕晃培養(yǎng)瓶沖洗細(xì)胞，吸棄，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃消化約40s。倒置顯微鏡下見細(xì)胞回縮、變圓，細(xì)胞成片收縮呈球形時(shí)，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打瓶壁細(xì)胞使其完全脫落，形成的細(xì)胞懸液按1∶2或1∶3接種。周期約為5～7d。首次傳代時(shí)，脫落的組織塊可以轉(zhuǎn)移到新的25cm2培養(yǎng)瓶中，按原代培養(yǎng)方法使組織塊重新貼壁。24h后可見細(xì)胞重新貼壁生長。以后約2～3d換液1次，1周左右后細(xì)胞再次長成致密單層時(shí)即可再次傳代。待細(xì)胞傳代至3～5代，即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇 凍存時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞，凍存前一天最好換液。消化細(xì)胞將其收集于離心管，計(jì)數(shù)、離心后棄上清液，加凍存液（DMSO、血清、DMEM 培養(yǎng)基以 1∶3∶6 配制），使細(xì)胞的最終密度為（5～10）×106/ml，分裝入凍存管中，置4℃冰箱冷卻1h后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱冷卻2h，最后保存在-70℃冰箱中。復(fù)蘇時(shí)從-70℃冰箱中取出凍存管，直接投入37℃水浴箱中，使其盡快融化。用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管加含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，離心后棄上清液。培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種于培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2．1 平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)第4～7d，可見少量細(xì)胞自組織塊邊緣游出，但不是所有的組織塊周邊都有，漸向外生長形成細(xì)胞暈，進(jìn)而形成細(xì)胞簇，且形態(tài)多樣（梭形、多角形、星形或不規(guī)則形），大小略有差異。此后細(xì)胞呈放射性生長，至第10d，隨著細(xì)胞的增殖，培養(yǎng)瓶內(nèi)可見大量細(xì)胞平行生長鋪滿瓶底。部分區(qū)域細(xì)胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰-谷”狀生長。傳代后80%～90%的細(xì)胞可重新貼壁生長，其生長方式及形態(tài)特點(diǎn)同前。

2.2 VSMC組織學(xué)鑒定

培養(yǎng)第5代的細(xì)胞經(jīng)特異的SMα-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，胞漿著棕黃色，呈陽性表達(dá)。此免疫組化結(jié)果表明，所得細(xì)胞確為典型的VSMC。

3 討論

VSMC的增殖是介入術(shù)后再狹窄發(fā)生和動(dòng)脈硬化（AS）過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展和血管損傷的反應(yīng)中，VSMC遷移至血管壁內(nèi)膜下，離開靜止期G0/G1，進(jìn)入細(xì)胞周期促進(jìn)病變的反應(yīng)[4]。因此，研究防治VSMC增殖成為血管生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。體外VSMC為尋找新的防治方法提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

研究表明，平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈中膜唯一類型的細(xì)胞，因此主動(dòng)脈中膜可作為獲取平滑肌細(xì)胞的最佳來源。目前，常用的方法有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法雖然培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高，但膠原酶價(jià)格昂貴，且試驗(yàn)中污染機(jī)會(huì)大，最佳消化時(shí)間不好把握，消化酶本身對細(xì)胞有毒性作用，易消化過度導(dǎo)致細(xì)胞活力不佳。組織塊貼壁法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高、量多，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，可避免酶消化法的上述弊端。

在培養(yǎng)過程中，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）選擇血管供體時(shí)，一般選用120～150g的大鼠。體重太小，血管細(xì)，操作困難；體重太大則細(xì)胞活力弱，不易生長。（2）取下胸主動(dòng)脈至將組織塊種植到培養(yǎng)瓶時(shí)間最好不要超過半小時(shí)；嚴(yán)格無菌操作，減少污染機(jī)會(huì)。（3）剝除血管外膜和內(nèi)膜時(shí)，動(dòng)作輕柔，避免用力牽扯，使細(xì)胞受傷，活力下降。（4）分離中膜時(shí)，要徹底剝離內(nèi)膜與外膜，以減少內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染。（5）組織塊大小以1mm3較為合適，邊緣整齊、光滑，以利于細(xì)胞游出。注意細(xì)胞密度，一般取2～3只大鼠的胸主動(dòng)脈組織塊均勻接種于25ml培養(yǎng)瓶中，間隙約2～3mm，以保證細(xì)胞游出后有足夠的生長空間并保持細(xì)胞密度的均勻。（6）組織塊干涸貼壁后及時(shí)翻正培養(yǎng)瓶，時(shí)間約為1.5～3h。干涸時(shí)間短有利于細(xì)胞存活，但不利于貼壁。（7）及時(shí)清理漂起的組織塊?？蓪⑵鸬慕M織塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中重新貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)。（8）營養(yǎng)液中血清質(zhì)量是關(guān)系到培養(yǎng)能否成功的重要因素，最好使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清，原代培養(yǎng)時(shí)可將血清濃度提高到25%，消化傳代后營養(yǎng)液中血清濃度為15%。（9）一般3～5d換液1次，換液時(shí)不可將瓶內(nèi)原培養(yǎng)液全部換掉，應(yīng)保留1/3原培養(yǎng)液，然后加入新鮮培養(yǎng)液至原量。這樣可使細(xì)胞保持相對穩(wěn)定的體液環(huán)境，又不致缺乏營養(yǎng)，有利于細(xì)胞保持正常的生長速度。

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1671-1246（2010）03-0097-02