張 穎,楊 舸

(1.攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川 攀枝花 617000;2.攀枝花學(xué)院 生物與化工研究所,四川 攀枝花 617000;3.攀枝花市食品與藥品監(jiān)督管理局,四川 攀枝花 617000)

1 雙向電泳的原理和方法

雙向電泳技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點和分子量兩個相互獨立的參數(shù),在相互垂直的兩個方向進行二次電泳的過程.首先在第一向電泳中根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)進行等點聚焦(IEF),等點聚焦時由于各種蛋白等電點的不同,在高電壓場的作用下,蛋白質(zhì)在pH梯度膠中移動,直到取得不同的位置;然后再根據(jù)蛋白分子量的不同,在SDS-烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)中進行第二次分離.

第一向等點聚焦有 3種常見的方法:非固相的 ISO-DALT、固相的 IPG-DALT和非平衡的NEPhGE.其中 NEPhGE主要用于分離堿性蛋白質(zhì).目前 IPG-DALT已經(jīng)取代其他兩者成為等點聚焦的主要手段.它的優(yōu)勢在于[1]:pH梯度穩(wěn)定,聚焦準(zhǔn)確,精度高;無陰極漂移及堿性蛋白丟失的現(xiàn)象;蛋白上樣量大,可以提高低豐度成分的分辨效果;樣品中鹽的干擾少,無邊緣效應(yīng);pH梯度和分離結(jié)果的重復(fù)性好.第二向 SDSPAGE電泳只有垂直和水平兩種形式,水平電泳可防止凝膠在染色過程中變形,因為凝膠厚度減小(可至0.5mm),獲得的蛋白點的分辨率較高,而且可以應(yīng)用較高電壓,縮短了電泳時間從而減少蛋白擴散[2];垂直電泳則可同時跑多塊膠,有利于應(yīng)用計算機割點并進行平行差異分析,大大提高效率.現(xiàn)在國內(nèi)大多數(shù)實驗室所用的都是垂直的第二向電泳.

2 雙向電泳的主要技術(shù)步驟

2.1 樣品制備

樣品制備是雙向電泳的關(guān)鍵,主要包括蛋白溶解、變性、還原等步驟,去除鹽離子、色素、酚類和核酸等非蛋白物質(zhì),以保證順利電泳.樣本預(yù)處理的重點在于提高難溶蛋白的溶解度以及去除看家基因的表達產(chǎn)物對低豐度蛋白的掩蓋作用.現(xiàn)在已有提取不同組份蛋白的試劑盒,提高了樣品處理效率和重復(fù)性,但蛋白質(zhì)的種類及特性千差萬別,所以要想用一種“標(biāo)準(zhǔn)”的樣本溶液成分同時溶解并提取所有不同來源的樣本的蛋白幾乎是不可能的.根據(jù)實驗要求的不同,可按各種屬性將蛋白分別提取,比如 Molloy等[3]用3種分別適合溶解高、中、低親水性蛋白質(zhì)的裂解液分步提取大腸桿菌蛋白質(zhì).對于低豐度蛋白的提取,可在樣本中加入蛋白酶抑制劑以防蛋白質(zhì)水解,在樣本處理中盡量富集低豐度蛋白,并采用靈敏度較高的銀染或熒光染色.

2.2 電泳(IEF/SDS-PAGE)

電泳包括 IEF、IPG膠條的平衡和 SDS-PAGE三個主要步驟.為了保證良好的電泳重復(fù)性,目前一般實驗室 IEF通常都使用商業(yè)化的預(yù)制 IPG干膠條,可以根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇使用連續(xù)性或非連續(xù)性 pH梯度膠條、寬 pH梯度或窄 pH梯度膠條.平衡的作用在于充分打開蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵,進行蛋白的烷基化,修飾蛋白的自由巰基,阻止斷開的二硫鍵重新形成,以便進行下面的 SDS-PAGE.第二向 SDS-PAGE可根據(jù)實驗要求采用水平和垂直兩種方式,水平膠厚度小,分辨率高,而垂直電泳體系效率高,可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析.

2.3 凝膠的染色

PAGE凝膠的染色方法有很多種,主要包括有機染料染色如溴酚藍染色、氨基黑染色和考馬斯亮藍染色等,銀染,負染,膠體擴散染料染色,膠體金屬染料染色,熒光染色,金屬螯合染料染色,放射自顯影等多種方法.目前常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染以及熒光染色等[4].考馬斯亮藍染色是經(jīng)典方法,但靈敏度較低.銀染靈敏度要高得多,但是重復(fù)性難以控制,而且對質(zhì)譜檢測有干擾.熒光染色靈敏度高而且不需要染色后固定脫色等處理步驟,可以減少蛋白特別是低分子量蛋白丟失[5],缺點在于成本太高,而且只有含賴氨酸殘基的蛋白才能被熒光染料標(biāo)記.

2.4 圖像分析

染色后得到的雙向電泳凝膠圖譜上有大小、明暗度和位置等各不相同的蛋白斑點,接下來的工作就是利用計算機輔助圖像軟件進行定量分析并獲取大量有關(guān)這些蛋白斑點等電點和分子量的信息,具體操作[6]包括:數(shù)據(jù)的獲取,用圖像掃描儀、熒光測定儀等采集凝膠圖像;圖像加工,進行背景和污點的校正,濾掉一部分背景及去除部分水平和垂直條紋;斑點檢測和定量,把凝膠上的蛋白點數(shù)字化,得到斑點面積、每點相對黑度等參數(shù),可根據(jù)蛋白點面積的大小和顏色的深淺進行定量分析;凝膠配比,消除使圖像變形的參數(shù),將其轉(zhuǎn)變成可比較的圖像,隨后進行配比,以得到理想的凝膠圖譜,便于分析蛋白的變化;數(shù)據(jù)分析,分析凝膠中有效蛋白斑點數(shù)目、強度飽和的斑點數(shù)目和配比的斑點數(shù)目;數(shù)據(jù)呈遞,計算每個被檢測的蛋白斑點 Mr(分子量)/Ip(等電點)值;建立 2-DE數(shù)據(jù)庫,用前面分析的許多諸如蛋白名稱、Mr/Ip和目錄性信息以及其它文獻的描述性信息構(gòu)建數(shù)據(jù)庫[7].

3 雙向電泳的技術(shù)特點及存在問題

3.1 分辨率

一般的雙向電泳能分辨 1 000～3 000個點,是目前分析組份復(fù)雜蛋白分辨率最高的工具[8].雙向電泳的分離能力取決于雙向上的長度,通常認(rèn)為與有效的分離面積成正比[9],對于特別復(fù)雜的樣品,要獲得最大分辨率,用特大膠可以從全細胞裂解液中分離得到 5 000～10 000個蛋白點[10].IPG干膠條,水平電泳,在有效范圍內(nèi)增大凝膠面積等措施都有助于提高分辨率.如利用多塊重疊范圍放大 IPG膠來生成復(fù)雜樣本的 2-DE蛋白圖譜[11]更具有明顯優(yōu)勢.但細胞內(nèi)含有大約 3～5萬種蛋白質(zhì),所以現(xiàn)有的分辨率還遠遠不能滿足分析細胞全蛋白的需要,特別是對細胞內(nèi)的低豐度蛋白、極端酸性和堿性蛋白、分子量過大或過小蛋白、難溶蛋白等的電泳分離仍面臨很大困難.

3.2 重復(fù)性

雙向電泳的重復(fù)性一直是限制 2-DE被進一步廣泛應(yīng)用的瓶頸所在,它關(guān)系到不同實驗室之間數(shù)據(jù)交換和利用,也直接影響蛋白質(zhì)組研究的價值和應(yīng)用[12].以 IPG膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的基于兩性電解質(zhì)的等點聚焦,較大程度上提高了雙向電泳的重復(fù)性,但并非徹底解決.此外還可以通過省去濃縮膠,在第二向電泳中使用連續(xù)的分離膠等一些簡化步驟的手段以減少操作誤差,當(dāng)然如果能將整個電泳過程實現(xiàn)自動化就能徹底消除操作誤差.

3.3 雙向電泳圖譜的信息化

將雙向電泳所得到的大量蛋白質(zhì)組圖譜用來建立蛋白質(zhì)組圖譜數(shù)據(jù)庫,即對數(shù)字化蛋白點的分布部位、斑點面積和灰階、背景過濾、2-DE凝膠配比,建立參考圖譜.研究者可根據(jù)自己的需要對數(shù)據(jù)庫進行檢索,找到對應(yīng)的參考圖譜進行比對分析,只要是在極為標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟下得到的凝膠圖譜,就可以根據(jù)蛋白點在圖像上的位置和已知的數(shù)據(jù)庫進行比較來鑒定一些蛋白.現(xiàn)在國際上已有一些由權(quán)威研究所和公司開發(fā)的公共數(shù)據(jù)庫,每個數(shù)據(jù)庫都包含了大量的信息,并且在日益完善中.比如 SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫,里面有許多標(biāo)準(zhǔn)的凝膠圖像以及預(yù)測蛋白質(zhì)在凝膠上位置變化的方法,可以用來比對分析以鑒定蛋白.但是由于技術(shù)上的差異(樣本制備、IEF、SDS-PAGE、染色等)使每個實驗室得到的蛋白質(zhì)組圖譜都不完全一樣,這就給資源共享帶來了很大困難,但隨著操作技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化及自動化的逐步實現(xiàn),信息資源的完全共享將成為可能.

3.4 雙向電泳的技術(shù)缺陷

樣本中實際蛋白濃度差可能達到 1000 000倍,而雙向電泳最多只能顯示 100倍的蛋白濃度差.雙向電泳只適合用來分析高豐度范圍的蛋白質(zhì),為了得到有意義的結(jié)果及提高分辨率,制備純的蛋白質(zhì)組(95%～99%)是必要的,而且由于生物質(zhì)譜技術(shù)的高敏感性,如果蛋白質(zhì)組被污染,將會導(dǎo)致蛋白質(zhì)組被錯誤地注釋,這就給操作帶來了難度.另外許多蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測技術(shù)都不是定量的(例如質(zhì)譜技術(shù)),或者只在一定范圍內(nèi)定量(例如銀染和考馬斯亮藍染色),這就使定量地研究蛋白質(zhì)表達的正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)變得很困難,差異凝膠電泳和同位素代碼標(biāo)記的出現(xiàn),對以雙向電泳為核心的傳統(tǒng)方法提出了創(chuàng)新和改進,為解決這個問題指出了一個方向.

4 雙向電泳的發(fā)展前景

雙向電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn):1)提高蛋白的溶解度和染色的靈敏度.2)低豐度蛋白以及難溶性蛋白的分離.3)在不影響分辨率的前提下提高上樣量以提高 2-DE凝膠圖像的分析和數(shù)據(jù)開發(fā)性能.4)缺乏靈敏可靠的蛋白檢測手段和定量方法.5)極酸或極堿蛋白以及分子量極大或極小的蛋白的分離.6)要得到高質(zhì)量的凝膠圖像需要高度標(biāo)準(zhǔn)化的操作.

隨著雙向電泳技術(shù)體系的進一步發(fā)展,會不斷出現(xiàn)新的樣本處理方法、染色方法以及經(jīng)過改進的電泳方法.例如目前流行的雙向差異凝膠電泳(Two-dimensional different gelelectrophoresis,2-D DIGE)通過多元分析得到更多的蛋白質(zhì)組信息,大大提高了凝膠之間的重復(fù)性和結(jié)果的可信度.

5 結(jié)語

綜上所述,雙向電泳的分辨率高,但重復(fù)性有待加強,蛋白質(zhì)圖譜資源有待共享化.雖然受到許多其他新技術(shù)的挑戰(zhàn),但其對于分離檢測細胞、細胞系、器官和組織的總蛋白質(zhì)組是最有效的方法之一,同時與其他蛋白質(zhì)組研究技術(shù)(如生物質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)復(fù)合物純化技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)等)互補長短,一起為解決這個領(lǐng)域的諸多問題發(fā)揮巨大作用.

[1]Wang Y H,Cheng Z.Echinococcusmultilocularis:Proteomic analysis of the p rotoscoleces by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J].Experimental Parasitology,2009,123(2):162.

[2]馬馳,劉淑清,宋軍衛(wèi),等.雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜初步分析蛇島蝮蛇毒蛋白質(zhì)組[J].動物學(xué)雜志,2009,44(4):70-77.

[3]范云峰,謝虹,梁建生.雙向電泳中 4種常用染色方法的靈敏度比較[J].揚州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,29(4):80-83,89.

[4]Wilkins M.Government backs proteome p roposal[J].Nature,2005,378:653.

[5]景愛紅.雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用體會[J].解剖學(xué)雜志,2008,31(5):728-729.

[6]G?rg A,Obermaier C,Boguth G,et al.The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J].Electrophoresis,2000,21:1037-1053.

[7]Molloy M P,Herbert BR,Walsh B J,et al.Extraction of membrane proteins by different ialsolubilizati-on for separation using two-dimensional gel electrophoresis[J].Electrophoresis,2000,19(5):837-844.

[8]WilkinsM R,Sanchez,JC,Gooley A A.Progress with proteome projects:why all proteins exp ressed by a genome should be identified and how to do it[J].Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,2001,13(1),19-50.

[9]Gert Van den Bergh,Lutgarde Arckens.Fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis unveils the potential of gel-based proteomics[J].Current O-pinion in Biotechnology,2004,15:38-43.

[10]李德軍,鄧治,陳春柳,等.植物組織雙向電泳樣品制備方法研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2009,25(24):78-82.

[11]Knecht M,Regitz-Zagrosek V,Pleissner K-P,et al.Computer-assisted analysis of endomyocardial biopsy protein patterns by two-dimensional gel electrophoresis[J].European Journal of Clinical Chemistry and Clinical BioChemistry,2004,34:159-165.

[12]王英超,黨源,李小燕,等.蛋白組學(xué)及其技術(shù)發(fā)展[J].生物技術(shù)通訊,2010,38(3):1135-1138.