陳子秋,肖啟賢 綜述,郭偉韜 審校

(1.廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524032;

2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科,廣東 湛江 524001)

·綜 述·

神經(jīng)突觸研究方法的進展

陳子秋1,肖啟賢1綜述,郭偉韜2審校

(1.廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524032;

2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科,廣東 湛江 524001)

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位,具有接受、整合和傳遞信息的功能,神經(jīng)元通過一級級嚴謹有序的方式形成了復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。而突觸則是整個系統(tǒng)最小的功能單位,通過突觸的連接使神經(jīng)元相互之間以及神經(jīng)元和效應器得以傳遞信號。突觸不僅是研究神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理和功能的基礎(chǔ),同時也是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病機制的突破口。本文就目前有關(guān)神經(jīng)突觸研究方法的概況和新進展作一綜述。

神經(jīng)突觸;電子顯微鏡;電生理;可視熒光技術(shù)

神經(jīng)系統(tǒng)是生命活動中起整合和調(diào)節(jié)作用的信息系統(tǒng)。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位,具有接受、整合和傳遞信息的功能,神經(jīng)元通過一級級嚴謹有序的方式形成了復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。突觸(Synapse)是神經(jīng)元之間相互接觸的部位,在反射活動中各種神經(jīng)沖動都要通過突觸進行傳導,可以說突觸是整個神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的最小功能單位,因此各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的研究都是以突觸為突破口的。而是否能選擇一種符合研究方向的突觸檢測方法則很大程度上決定了研究的成敗。

1 形態(tài)學觀察法

經(jīng)典的突觸由突觸前部、突觸間隙和突觸后部三部分組成。突觸前部和突觸后部相對應的細胞膜較其余部位略增厚,分別稱為突觸前膜和突觸后膜,兩膜之間的狹窄間隙稱為突觸間隙。在突觸前膜部位的胞漿內(nèi),含有許多突觸小泡 (Synaptic vesicle)以及一些微絲和微管、線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。突觸小泡是突觸前部的特征性結(jié)構(gòu),小泡內(nèi)含有化學物質(zhì),稱為神經(jīng)遞質(zhì)(Neurotrans mitter)。各種突觸內(nèi)的突觸小泡形狀和大小頗不一致,是因其所含神經(jīng)遞質(zhì)不同。

觀察突觸形態(tài)最早使用的方法是普通光學顯微鏡,但是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前終末的容積一般只有 10-15L。因此,我們很難用光學顯微技術(shù)分析在整個突觸水平發(fā)生了什么,也無法輕易的分辨出神經(jīng)突觸終末的細微空間結(jié)構(gòu)[1]。但現(xiàn)在一些新的技術(shù)也逐漸用于突觸研究。

1.1 電子顯微鏡 (Electron microscope,EM)目前常用的主要有透射電子顯微鏡 (Transmission electron microscopy,TEM)、能量過濾透過式電子顯微鏡 (Energy filtered transmission electron microscopy,EFTEM)、掃描電子顯微鏡 (Scanning electron microscope,SEM)。EM主要用來觀察突觸數(shù)目和超微結(jié)構(gòu)。20世紀 50年代中期,正是電鏡應用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究,突觸的結(jié)構(gòu)才被認可。早期對樹突的電鏡觀察證實了游離核糖體和膜結(jié)合核糖體的存在。國內(nèi)有學者[2]通過 TEM觀察到飲酒后的小鼠海馬CA-1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的突觸后膜致密物質(zhì)厚度、突觸活性區(qū)長度及突觸間隙寬度均顯著性變小,從而在形態(tài)學方面證明了酒精可以引起突觸的可塑性變化,并影響神經(jīng)沖動的傳遞功能甚至學習記憶。Ventura等[3]利用三維電鏡技術(shù)觀察了成年大鼠海馬 CA-1區(qū)域中星形膠質(zhì)細胞和突觸的空間位置關(guān)系,為更直觀地了解細胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供了新的工具。利用 EM觀察時不足之處是樣本必須在真空中觀察,因此無法觀察活樣本。在處理樣本時可能會產(chǎn)生樣本本來沒有的結(jié)構(gòu),這加劇了此后分析圖像的難度。

1.2 原子力顯微鏡 (Atomic force microscope,AFM) AFM是一種利用原子、分子間的相互作用力來觀察物體表面微觀形貌的新型實驗技術(shù)。它有一根納米級的探針,被固定在可靈敏操控的微米級彈性懸臂上。當探針非?？拷鼧悠窌r,其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會使懸臂彎曲,偏離原來的位置。根據(jù)掃描樣品時探針的偏離量或振動頻率重建三維圖像,就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。相對于掃描電子顯微鏡,原子力顯微鏡具有許多優(yōu)點:首先,不同于電子顯微鏡只能提供二維圖像,AFM可以提供真正的三維表面圖。同時,AFM不需要對樣品的任何特殊處理,如鍍銅或碳,從而避免了這種處理對樣品造成的不可逆性傷害。其次,電子顯微鏡的運行需要在高真空條件下,而原子力顯微鏡在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作,這樣可以更方便的研究生物宏觀分子,甚至活的生物組織。Parpura等[4]曾用原子力顯微鏡對固定的和活的海馬神經(jīng)元進行了成像。AFM的缺點在于成像范圍太小、速度慢,受探頭的影響太大。此外AFM購買和維護的價格都比較高,為其普及增加了難度。

2 免疫組織化學法

指在抗體上結(jié)合熒光或可呈色的化學物質(zhì),利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應,檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在,此方式不僅可以用來測知抗原的表現(xiàn)量,而且可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。具有高度特異性、靈敏性和精確性。目前已發(fā)現(xiàn)的一系列突觸蛋白家族成員 (突觸蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)大部分可作為目標抗原證明突觸的存在和位置,其中突觸素是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì),與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放直接相關(guān),有研究者建議對其檢測可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸功能建立、維持和(或)喪失、恢復的敏感指示器。然而,雖然通過辨別突觸蛋白來確認新突觸發(fā)生已經(jīng)得到廣泛應用,但用突觸蛋白的斑點狀定位辨別突觸不是絕對可靠的,尤其是一些新生突觸在形成過程的早期還沒有某種突觸蛋白時更是如此,此法還存在抗體的特異性與交叉反應的問題。因此,對這種方法的結(jié)果應作仔細分析。

3 可視熒光技術(shù)

功能是突觸發(fā)育成熟的標志,可視熒光技術(shù)能進行實時顯像,使對活體突觸功能進行研究更為容易。熒光標記生物膜及熒光標記蛋白是最常見的可視成像技術(shù)。它能特異性地標記突觸囊泡,發(fā)出熒光,而又不影響突觸囊泡的活性和運轉(zhuǎn)。在突觸事件中依照熒光強度的變化就可以推斷相應的神經(jīng)胞吞及胞吐的程度,跟蹤突觸囊泡運輸循環(huán)過程。

3.1 熒光膜追蹤劑 F M1-43標記技術(shù) F M1-43屬于苯乙烯類熒光染料中最常用的一種,是一種具有雙極性的熒光染料,親水基團與親脂基團分別位于分子的兩端。它可以選擇性地對正在進行外吐和內(nèi)吞的分泌型生物膜進行染色。FM1-43在靜息狀態(tài)下依靠其親脂尾部插入脂質(zhì)膜外葉,給予一定的外部刺激 (實驗中一般選擇高鉀刺激或電刺激)誘發(fā)遞質(zhì)釋放后,一部分熒光染料就會隨著突觸囊泡的內(nèi)吞而成為突觸囊泡膜的一部分。刺激過后,殘留在膜外葉的剩余染料則可用洗脫液洗脫下來[5-6]。當 FM1-43游離在水溶液中時,它的熒光強度很弱幾乎覺察不到;但當它們被插入至疏水環(huán)境時,它的熒光強度將呈幾十倍的增強[7]。因此,此時細胞內(nèi)的 FM1-43的熒光強度在一定程度上就可以定量地反映這一次刺激誘發(fā)下胞吞的程度。如果進行再次刺激,苯乙烯類染料就會隨著囊泡的胞吐,與神經(jīng)遞質(zhì)一起釋放到突觸間隙,而此時熒光強度的減弱就可以反映出胞吐的程度。Ryan[8]用 FM1-43獲得了培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元軸突和樹突之間的突觸連接的圖像,并將其應用在運動的突觸囊泡中,可在樹突及突觸體上觀察到標記點,通過計算熒光強度對突觸功能進行分析。國內(nèi)周濤等[9]使用未分化的 PC12細胞作為種植神經(jīng)元的來源,在神經(jīng)生長因子(NGF)作用下分化成神經(jīng)元樣細胞,并與原代皮質(zhì)神經(jīng)元建立模擬移植環(huán)境的共培養(yǎng)體系,利用FM1-43造影研究了細胞移植環(huán)境中宿主細胞與移植細胞突觸形成的可能性。FM1-43自身也存在一些局限性,這主要體現(xiàn)在時間分辨率較差,無法提供毫秒級的變化資料及難以排除一些來自非突觸囊泡產(chǎn)生的噪聲的干擾等方面。

3.2 Fura-2熒光探針技術(shù) Fura-2與鈣螯合劑 EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)一樣,具有四羧酸的 Ca2+螯合中心,能特異性與 Ca2+結(jié)合,不同的是 Fura-2可發(fā)出熒光,并且與 Ca2+結(jié)合后其熒光光譜發(fā)生變化。其具熒光強度高、波長漂移、反應速度快、自身熒光小、對 Ca2+選擇性好和測定靈敏等優(yōu)點,系目前測定細胞內(nèi) Ca2+濃度應用最廣的熒光指示劑[10-11]。Fura-2可與胞漿內(nèi)游離 Ca2+結(jié)合形成 Fura-2-Ca2+復合物。Fura-2與 Fura-2-Ca2+復合物的最大激發(fā)光波長分別為 380nm和340nm,其發(fā)射光的強度與Ca2+濃度呈正比,據(jù)此可測定 Ca2+及其變化。正常情況下突觸的傳遞過程,是神經(jīng)沖動沿軸膜傳至突觸前膜時,觸發(fā)前膜上的電壓門控鈣通道開放,細胞外的 Ca2+進入突觸前部,在ATP和微絲、微管的參與下,使突觸小泡移向突觸前膜,以胞吐方式將小泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙。因此突觸內(nèi) Ca2+的濃度可反映突觸的功能活動,國內(nèi)已有學者利用 Fura-2測定突觸體胞漿游離 Ca2+濃度[12],提供了正常突觸體內(nèi) Ca2+濃度的相關(guān)數(shù)據(jù)。Fura-2熒光染料的局限性,容易受 pH、溫度、外界 Ca2+的影響,在實際操作中需注意。

3.3 谷氨酸(Glu)遞質(zhì)釋放的連續(xù)熒光分析法

中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸 (Glu)從突觸前的釋放,是 Glu神經(jīng)傳導的重要部分,在許多 Glu釋放的分析檢測技術(shù)中,最近發(fā)展的 Glu連續(xù)熒光分析法有許多優(yōu)點。此法快速而靈敏度高,可對 Glu釋放作動態(tài)的檢測。原理:從突觸前膜釋放的 Glu,在谷氨酸脫氫酶 (GDH)作用下,可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP)發(fā)生氧化還原反應,生成煙酰胺腺嘌呤二核酸(NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)以及α-酮戊二酸[13]。隨著NAD或 NADP被還原成NADH或NADPH,會引起熒光快速增加而為熒光光度計檢測到。通過標準 Glu的加入,可對釋放的Glu精確定量。Glu的釋放和攝取是其突觸調(diào)控中很重要的方面。含 Glu的囊泡在去極化條件下,是依賴于 Ca2+的胞泌機制釋放的[14]。Glu釋放的主要部分發(fā)生在 Ca2+內(nèi)流的平臺期,是由 Ca2+通過非失活性通道內(nèi)流而觸發(fā)的。通過對突觸體 Glu釋放的分析,不僅為檢測突觸功能提供了另一可靠指標,也為研究神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供了有效的研究方法。例如朱曉峰等[15]研究致癇劑馬桑內(nèi)酯對谷氨酸攝取和釋放功能的影響,闡明了馬桑內(nèi)酯致癇的可能機制是使谷氨酸釋放增加,攝取減少,突觸間隙谷氨酸聚積所造成。隨著分析、檢測 Glu釋放技術(shù)的發(fā)展,不但可以探明 Glu從突觸前膜的釋放機制這一神經(jīng)生物學上的重要問題,而且也能提供一種更便捷的方法,去研究在不影響 Glu的正常神經(jīng)傳導條件下,對 Glu異常釋放,造成對 Glu受體的濫刺激所致神經(jīng)毒性的拮抗。

3.4 綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP) 隨著光學顯微鏡的發(fā)展,熒光標記蛋白技術(shù)已成為許多活體成像研究中必不可少的一種工具。許多學者將其應用于活體細胞突觸形成的研究,其中應用最廣泛的熒光標記蛋白為綠色熒光蛋白(GFP)。它是一種功能獨特的蛋白質(zhì),編碼 238個氨基酸殘基,分子量為 2688Da。該蛋白受到紫外或藍光激發(fā)時可以自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并發(fā)出綠色熒光,其吸收波長為 395nm,發(fā)射波長為 509nm,從而可以被多種方法檢測。與其他熒光標記蛋白不同,GFP檢測不需要底物,在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活。Ahmari等[16]將GFP標記突觸前囊泡相關(guān)膜蛋白,又稱突觸小泡蛋白(Synaptobrevin)。利用實時熒光顯像技術(shù)發(fā)現(xiàn)突觸前囊泡在神經(jīng)元與它接觸的部位接觸前就可以識別到,一旦神經(jīng)元和它潛在的靶細胞建立實質(zhì)性的接觸,這些囊泡就會在突觸形成部位進行逐步釋放。此外,還可將 GFP作為蛋白質(zhì)標簽 (Protein tagging),即利用DNA重組技術(shù),將目的基因與 GFP基因構(gòu)成融合基因,轉(zhuǎn)染合適的細胞進行表達,然后借助熒光顯微鏡觀察活體細胞內(nèi)標記的蛋白質(zhì)位置和動態(tài)變化。Hartmann等[17]將綠色熒光蛋白 (GFP)標記腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)構(gòu)建 GFP-BDNF融合蛋白的質(zhì)粒,然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元,通過實時檢測海馬神經(jīng)元間谷氨酸型突觸部位 GFP-BDNF囊泡中熒光強度的變化來研究綠色熒光蛋白標記的BDNF的分泌情況。研究發(fā)現(xiàn)高頻刺激能激發(fā)谷氨酸型突觸囊泡中BDNF的釋放,并且這種釋放依賴于突觸后離子移變谷氨酸受體及突觸后鈣離子內(nèi)流的激活。GFP熒光檢測的一大缺點就是沒有放大作用,它不能像酶一樣通過加工無數(shù)的底物分子而將信號放大。因此 GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白,此外,檢測的靈敏度還有待進一步提高;熒光強度的非線性性質(zhì)使其定量非常困難。不過相信隨著通過對 GFP基因進行定點突變,一系列帶有不同的激發(fā)和發(fā)散波長的GFP突變株的開發(fā),以及隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和檢測方法的不斷完善,GFP標記系統(tǒng)將比現(xiàn)有的標記系統(tǒng)具有更多的優(yōu)勢。

4 電生理方法

神經(jīng)突觸的主要功能就是傳遞信息。信息傳遞的基本過程是突觸前神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)介質(zhì),神經(jīng)介質(zhì)作用于突觸后膜上的受體,引起動作電位。因此,在神經(jīng)突觸發(fā)育的研究中電生理指標有其特殊的重要性,電生理方法也是研究突觸是否具有成熟功能的最有效的方法。早期研究多使用電壓鉗技術(shù)。目前,應用最廣泛的是 Sakmann和 Neher[18]于1976年建立的膜片鉗技術(shù) (Patch clamp recording technique)。其突出優(yōu)點是能夠在維持細胞興奮過程中膜電位恒定的同時,直接記錄離子通道電流,反映單一的或多個的離子通道分子活動。其基本原理是用微玻管電極接觸細胞膜,以千兆歐姆以上的阻抗使之封接,使與電極尖端開口處相接的細胞膜小區(qū)域 (膜片)與細胞膜其他部分在電學上絕緣,在此基礎(chǔ)上固定電位,并對此膜片上離子通道的離子電流進行監(jiān)測記錄,以此來反映細胞膜上單一的或多個的離子通道分子活動的技術(shù)。膜片鉗主要有以下幾種記錄模式:細胞吸附模式、膜內(nèi)面向外模式、膜外面向外模式、全細胞模式、穿孔膜片模式、開放細胞吸附式、穿孔囊泡模式等。其中最常用的是全細胞記錄模式。Song等[19]報道,把 GFP敲入 (GFP+)的成體神經(jīng)干細胞和新生鼠海馬區(qū)原代的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中共同培養(yǎng) 2-4周,在第 6天時加入阿糖胞苷,以選擇非有絲分裂的神經(jīng)元。在共同培養(yǎng)兩周時,電鏡檢查發(fā)現(xiàn) GFP+神經(jīng)元和原代培養(yǎng)的神經(jīng)元既形成了對稱性的突觸結(jié)構(gòu),又形成了非對稱性的突觸結(jié)構(gòu)。全細胞膜片鉗記錄在注入去極化電流 (0.5-1nA)條件下可以反復激發(fā)動作電位的發(fā)生,且能夠被 0.5μmol/L的河豚毒素 (Tetrodotoxin,TTX)所阻斷。Ullian等[20]在培養(yǎng)兩周后的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 (Retinal ganglion cells,RGCs)測量到其由膠質(zhì)細胞引起的自發(fā)突觸活性的顯著增高。

電生理實驗方法也有一些欠缺和不便之處,如膜片鉗需要干凈的細胞膜表面,因此對細胞條件要求較高,且會破壞細胞的正常代謝和細胞骨架等。膜片鉗技術(shù)如果能進一步改良,在體內(nèi)環(huán)境中不改變細胞生理狀態(tài)的情況下檢測細胞的電生理特性,則能夠更準確地反映細胞的生存狀態(tài),評價細胞的突觸生理功能,為神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)研究、臨床應用及移植后評價提供更為可靠的客觀依據(jù)。

5結(jié)語及展望

雖然本文將突觸的研究方法分開介紹,但在神經(jīng)突觸發(fā)生發(fā)育的相關(guān)研究中往往需要多種方法的綜合運用,沒有超微結(jié)構(gòu)的詳細觀察,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)生和發(fā)育的描述就不夠完善;而缺乏相應的電生理功能的研究,結(jié)構(gòu)觀察的任何結(jié)果也不完全可信。譬如上述的膜片鉗技術(shù)和其他方法的結(jié)合,如和膜通道蛋白重組技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)和光譜技術(shù)結(jié)合起來,可以協(xié)同對離子通道進行全面而深入的研究;如和單細胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(Single cell RT-PCR)的結(jié)合,可以從電生理學角度和分子生物學角度揭示神經(jīng)干細胞(神經(jīng)元)的功能活動與結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系,檢測單個細胞上離子通道的藥理學和生物學特性,在同一個細胞上篩選出某些特定mRNA的表達,從而在基因水平鑒定形態(tài)相似而功能不同的細胞。因此,若要全面深入地了解神經(jīng)突觸的發(fā)生和發(fā)育進行就需要綜合以上手段,進行多模式研究。目前國內(nèi)已有報道用納米電極監(jiān)測囊泡及及突觸內(nèi)神經(jīng)信號的分子傳導[21]。

隨著神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理機制研究的不斷深化,對突觸功能更加詳盡的闡述將成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵性問題。我們也更加期待更新、更先進、更完善的檢測工具或檢測方法的誕生。

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R338.1+3

A

1003—6350(2010)19—122—04

廣東省自然科學基金(編號:8452402301001081)

廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金項目(編號:WSTJJ20081030410305196909162017)

陳子秋(1984—),男,湖北省十堰市人,在讀碩士研究生。

2010-06-22)