王 玲,張 嶄,梁瑞玲

(1.鄭州師范學(xué)院,河南鄭州450044;2.河南城建學(xué)院,河南平頂山467036;3.河南省疾病預(yù)防控制中心,河南鄭州450016)

近年來,有關(guān)蛋白質(zhì)與小分子間相互作用的研究成為人們研究的熱點,尤其關(guān)于藥物小分子與蛋白質(zhì)間相互作用的研究更是引起人們的廣泛興趣和共同關(guān)注。藥物小分子與蛋白質(zhì)間相互作用的研究不僅有助于從分子水平上了解蛋白質(zhì)與小分子的作用機(jī)理與規(guī)律,而且有助于認(rèn)識藥物的轉(zhuǎn)運和代謝過程,為新的高活性的藥物小分子的設(shè)計與開發(fā)研究提供有價值的信息及理論指導(dǎo)。

1 小分子與蛋白質(zhì)作用機(jī)理

小分子在血清白蛋白上至少有兩類結(jié)合：強(qiáng)結(jié)合和弱結(jié)合。在大多數(shù)情況下,強(qiáng)結(jié)合小于10[1]。小分子與蛋白質(zhì)相互結(jié)合的主要部位是蛋白質(zhì)上的堿性氨基酸殘基,這些堿性氨基酸殘基包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸和N端氨基,其間相互作用力有靜電作用力、疏水作用力和范德華力等。在通常情況下,其相互作用是靠多種作用力相互協(xié)同,而不是某一作用力的單獨作用的結(jié)果[2]。Kragh-Hansen[3]通過實驗詳細(xì)地研究了靜電力在小分子酚紅與血清白蛋白間所起的作用,并認(rèn)為疏水作用力也是小分子與蛋白質(zhì)相互作用的一種重要方式。Lakin[4]曾指出CBBG-250可以與蛋白質(zhì)的疏水部位依靠疏水作用力相互作用。MosheTal[5]認(rèn)為雖然蛋白質(zhì)所帶正電荷決定了所結(jié)合染料數(shù)目,但僅僅依靠靜電力是不能緊密結(jié)合的。Compton[6]用聚氨基酸與CBBG-250反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)不帶電荷的聚芳香族氨基酸與CBBG-250有反應(yīng)。這都表明非靜電力起了很大的作用。Jonas[7]專門研究了蛋白質(zhì)疏水區(qū)域與疏水熒光探針ANS的相互作用。在疏水氨基酸殘基中,色氨酸殘基最引人注意。有作者認(rèn)為疏水陰離子就是結(jié)合在色氨酸殘基附近[8]。因此,結(jié)合作用力一般不是某一種作用力的單獨作用,而可能是靜電引力、疏水作用力及范德華力等多種作用力的協(xié)同作用。

2 常用研究方法

有關(guān)藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究,目前已有多種方法與技術(shù)被引入此研究領(lǐng)域,比如紫外-可見吸收光譜、拉曼光譜、熒光光譜、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜、電化學(xué)、滲析、微量熱技術(shù)等等。綜合運用各種方法和手段可以得到有關(guān)藥物小分子-蛋白結(jié)合的各種信息。

2.1 紫外-可見吸收光譜法

紫外-可見吸收光譜法是研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的一種最方便的技術(shù)。小分子與蛋白質(zhì)的相互作用會引起吸收帶的紅移(藍(lán)移)現(xiàn)象或增色(減色)效應(yīng)。吸光度減小、吸收帶紅移以及等吸收點的形成是小分子與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的光譜標(biāo)志,據(jù)此可以進(jìn)行定性定量分析。文獻(xiàn)[9]發(fā)現(xiàn)向蘆丁溶液中滴加白蛋白時,蘆丁的特征吸收峰(350 nm)隨著白蛋白濃度的不斷增加,逐漸向長波方向移動。這種光譜變化反映出蘆丁分子與白蛋白之間發(fā)生了相互作用,蘆丁的最大吸收峰紅移說明其在白蛋白上結(jié)合后,其所處結(jié)合部位的極性加白較外部水溶液中減小,分子中π→π躍遷發(fā)生紅移現(xiàn)象。文獻(xiàn)[10]實驗中向鹽酸多環(huán)西素中滴蛋白時,隨著白蛋白濃度的不斷增加,鹽酸多環(huán)西素的紫外可見光譜的吸收強(qiáng)度降低,這也說明小分子與蛋白發(fā)生了相互作用。紫外吸收光譜一般與熒光發(fā)射光譜相互補(bǔ)充,利用二者圖形的重疊部分,按照能量轉(zhuǎn)移原理求出小分子與蛋白之間的結(jié)合距離。

2.2 熒光光譜法

熒光光譜法是研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的主要手段,這種方法無論是定性還是定量研究上都獲得了成功。它是19世紀(jì)發(fā)展起來的一種分析方法,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點。蛋白質(zhì)能夠發(fā)出熒光,是因為蛋白質(zhì)中存在三種芳香族氨基酸殘基-色氨酸(Trp)、酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)。蛋白質(zhì)的熒光通常在280 nm或更長的波長被激發(fā),而Phe在絕大多數(shù)實驗條件下不被激發(fā),所以很少能觀察到,通常熒光強(qiáng)度比為100∶9∶0.5[11]。因此,認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要來自色氨酸殘基,而且含色氨酸殘基的蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化值可以直接反映蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身和周圍環(huán)境的變化。另外,熒光光譜可以提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度等許多物理參數(shù),這些參數(shù)從各個角度反映了小分子與蛋白質(zhì)大分子的成鍵和結(jié)合情況。通過這些參數(shù)的測定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推測小分子與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理。如通過藥物小分子對蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的猝滅現(xiàn)象,確定猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù),可以了解藥物和蛋白的作用機(jī)理和作用強(qiáng)度。根據(jù)能量轉(zhuǎn)移原理,可以求出結(jié)合于蛋白的藥物分子距離蛋白色氨酸殘基的距離。另外,通過藥物分子與結(jié)合部位已知的熒光探針競爭蛋白結(jié)合部位,可以確定藥物在蛋白上的結(jié)合部位。所以認(rèn)為熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)的有效方法[12-17]。

小分子與蛋白質(zhì)作用時,可引起體系熒光性質(zhì)的改變,有兩種情況：⑴小分子無熒光,在蛋白質(zhì)溶液中加入小分子后,蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光被猝滅;⑵小分子有熒光,蛋白質(zhì)與小分子混合后,其內(nèi)源熒光被猝滅,同時小分子的熒光被敏化增強(qiáng)。在用熒光光譜法研究小分子與白蛋白的作用時,某些小分子在蛋白質(zhì)的熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長處有吸收,影響熒光強(qiáng)度的測量,即內(nèi)濾光效應(yīng)。文獻(xiàn)[18]提出了熒光校正方法。

除了常用的熒光分析方法,近年來還涌現(xiàn)了一些熒光光譜的新方法。如同步熒光光譜法和三維熒光光譜法。同步熒光技術(shù)是在同時掃描激發(fā)和發(fā)射波長時獲得的熒光光譜圖。藥物分子與蛋白作用時,常伴隨有蛋白構(gòu)象的變化,因此可以了解藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。Δ λ=15 nm作出的同步熒光光譜只顯示蛋白質(zhì)酪基酸的熒光,Δ λ=60 nm時的同步熒光光譜僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光。因氨基酸殘基的最大吸收波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān),故由氨基酸發(fā)射波長的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。若發(fā)射波長紅移表明氨基酸殘基所處環(huán)境的極性增加,則藍(lán)移疏水性增加。三維熒光光譜法是由激發(fā)波長(Y軸)—發(fā)射波長(X軸)—熒光強(qiáng)度(Z軸)三維坐標(biāo)所表征的矩陣光譜。其比二維的平面圖多了一個坐標(biāo),所得的總熒光數(shù)據(jù)又比普通熒光光譜多得多,故其具有高選擇性?？梢?與普通的熒光技術(shù)相比,同步熒光光譜、三維熒光光譜法有很多優(yōu)點。

2.3 核磁共振法和質(zhì)譜法

核磁共振法可應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象和性質(zhì)的研究[19-20],并能夠得到的結(jié)構(gòu)信息類型包括蛋白-小分子復(fù)合物的構(gòu)象、與生物大分子發(fā)生反應(yīng)的配體的質(zhì)子化狀態(tài)及配體的結(jié)合位點的位置和結(jié)構(gòu)。但此法不適宜定量研究結(jié)合參數(shù)。

質(zhì)譜分析是在真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子,通過對生成的離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測定來進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的一種方法。最近幾年電噴霧質(zhì)譜的發(fā)展使得質(zhì)譜在生物大分子研究中得到廣泛應(yīng)用。ESI作為一種最軟的電離方法,它能在不破壞蛋白與小分子、蛋白與蛋白形成的復(fù)合物的條件下檢測出這些復(fù)合物的存在[21]。使用ESI-MS檢測弱的非共價復(fù)合物時要特別注意溶液條件和一些參數(shù)的選擇。為減少在溶液狀態(tài)下非特異性靜電作用和氫鍵聚合物的形成,建議使用高濃度的緩沖鹽溶液。不過,ESI檢測到的小分子與蛋白質(zhì)是在氣態(tài)環(huán)境下的作用情況,而人體內(nèi)的生物大分子與小分子作用的環(huán)境是液態(tài)環(huán)境。同時,ESI僅僅只能直觀地觀察到小分子與蛋白質(zhì)的復(fù)合物,無法推導(dǎo)它們之間的作用機(jī)理。將質(zhì)譜法和核磁共振法聯(lián)用,能對藥物-蛋白的結(jié)合作用進(jìn)行多層次、全方位研究,可同時獲得配體的親和勢、化學(xué)計量學(xué)及結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息[22]。

2.4 電化學(xué)分析法

近年來,電化學(xué)分析方法在小分子與蛋白質(zhì)相互作用中也得到廣泛的應(yīng)用[23-24]。它作為一個很活躍的領(lǐng)域,其研究方法也處在不斷的發(fā)展中,如循環(huán)伏安法、線性掃描伏安法、常規(guī)脈沖法、差示脈沖法、計時電量法等等。電化學(xué)方法在研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用時,主要是根據(jù)小分子與蛋白質(zhì)作用前后氧化還原峰電流的變化、峰電位的移動進(jìn)行分析研究的。對于一些吸收光譜比較弱或者與蛋白質(zhì)作用前后光譜變化不明顯,無法用紫外可見、熒光等光譜手段來研究的分子,有可能用直接或者間接電化學(xué)方法進(jìn)行研究,從而獲得其他分析方法無法得到的信息。不過,電化學(xué)分析法在一定程度上受分子電活性的限制,另外其需樣量稍大,背景信號干擾相對較強(qiáng),而采用蛋白質(zhì)修飾電極的方法將有助于此類問題的解決。

2.5 微量熱法

微量熱法在測定過程中不會干擾生物體系的正常代謝活動,對反應(yīng)體系的光譜性質(zhì)、電學(xué)性質(zhì)及溶劑性質(zhì)等無任何條件限制。藥物-蛋白質(zhì)結(jié)合過程的熱力學(xué)性質(zhì)變化可用量熱法直接測定,在測定過程中也不需要添加任何試劑,故其有獨特之處[25]。常用的微量熱法有常規(guī)和差示掃描量熱(DSC)法等,這些方法已先后被用于一些抗腫瘤藥物、生物染料、藥物小分子與DNA或者蛋白質(zhì)的相互作用的研究中。如易平貴等[26-27]采用混和流動量熱方式研究了藥物小分子環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)、金霉素(Chlortetracycline,CTC)等與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明：隨著藥物的不同,反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)稍有差異。

2.6 其他方法

在研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的方法中,除了上述方法外,還有圓二色譜法、平衡透析法[28-29]、薄層色譜法、超濾法[30]及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬[30-32]等方法。

總之,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)了解的越清晰,小分子-蛋白質(zhì)相互作用的研究也愈來愈明朗,新的測試方法的出現(xiàn),更推動此類研究的進(jìn)展。但是值得注意的是：目前僅僅用一種方法是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足科學(xué)的發(fā)展的,必須綜合運用各種實驗方法和手段進(jìn)行全方位的研究才能得到更加可靠的結(jié)論。

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