彭建斐，戴良英，何玉科，許永漢

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.上海植物生命科學(xué)研究院，上海植物生理生態(tài)研究所，上海 200032；3.浙江省植物代謝基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021）

微小RNA（miRNA）是一種廣泛存在于真核生物中的21 nt左右的非編碼小分子RNA，絕大多數(shù)是真核生物基因表達(dá)的一類負(fù)調(diào)控因子。它主要在轉(zhuǎn)錄后水平上通過介導(dǎo)mRNA靶分子的切割或降低靶分子的翻譯來調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物器官的形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育、激素分泌與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物對(duì)外界環(huán)境脅迫因素的應(yīng)答能力。盡管植物微小RNA（miRNA）研究起步較晚，但由于鑒定方法的不斷發(fā)展，植物miRNA的報(bào)道數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。水稻作為單子葉模式植物和主要的糧食作物，其微小RNA（miRNA）研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。

1 水稻miRNA的生物合成

1.1 miRNA生物合成步驟

植物miRNA基因由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成為初級(jí)的轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA具有一段并不完全互補(bǔ)的雙鏈RNA區(qū)域，和一個(gè)大的發(fā)夾結(jié)構(gòu)[1]。接著，Pri-miRNA在RNA聚合酶III（Dicerlikel，DCLl）的作用下，被剪切成雙鏈的miRNA/miRNA*前體（pre-miRNA）[2-3]。這一對(duì)雙鏈的RNA分別被稱之為指導(dǎo)鏈和伴隨鏈，與miRNA*的5′端相比，miRNA的5′端配對(duì)更不穩(wěn)定，可能正是這種特點(diǎn)導(dǎo)致了miRNA最終進(jìn)入RISC復(fù)合體，miRNA*被排除在RISC外而降解[4]。

1.2 miRNA生物合成相關(guān)蛋白

Dicer-like1（DCL1）是miRNA生物合成所最必需的蛋白，DCL1將具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pri-miRNA剪切加工成雙鏈的pre-miRNA。Dicer酶具有一個(gè)位于氨基酸末端的DExH-box RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域，一個(gè)在ARGONAUTE（AGO）也具有的PAZ結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和一個(gè)碳端的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[5]。水稻中具有 6個(gè) DCL1蛋白 OsDCL1、OsDCL2a、OsDCL2b、OsDCL3a、OsDCL3b 和 OsDCL4[6]。曹曉風(fēng)等[7-8]通過RNA干擾技術(shù)（RNAi）獲得了OsDCL1和OsDCL4功能缺失的水稻轉(zhuǎn)化體，深入研究顯示，miRNA含量在dcl1轉(zhuǎn)化體中顯著下降，而在dcl4轉(zhuǎn)化體中卻沒有明顯變化，表明OsDCL1對(duì)于miRNA的發(fā)生具有重要的作用。

ARGONAUTE（AGO）是一種miRNA的效應(yīng)復(fù)合體，能與成熟的miRNA結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）來調(diào)控靶基因的表達(dá)。AGO蛋白質(zhì)主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，但具體功能現(xiàn)在尚不清楚。最近的研究表明，PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合到siRNA的3′的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白質(zhì)的PIWI結(jié)構(gòu)域賦予slicer以內(nèi)切酶的活性。同時(shí)，不同的AGO蛋白質(zhì)有著不同的生物學(xué)功能。北京生命科學(xué)研究院的戚益軍研究組[9]同樣利用RNAi技術(shù)同時(shí)沉默了水稻的4個(gè)AGO1基因，研究顯示，水稻轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)了復(fù)雜的發(fā)育表性，還發(fā)現(xiàn)AGO1蛋白具有切割mRNA的活性，并且它們都對(duì)U起始的小分子RNA具有偏好性。作者進(jìn)一步克隆了與AGO1結(jié)合的小分子RNAs并進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)AGO1s主要結(jié)合已知的miRNAs，表明這些AGO1對(duì)調(diào)節(jié)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用。

在植物miRNA合成途徑中，還有其他非常重要的蛋白起著非常重要的作用，HYL1（HYPONASTIC LEVEAL 1）和 SE（SERRATE）被認(rèn)為能夠幫助DCL1精確快速地剪切雙鏈RNA產(chǎn)生pre-miRNA[10]。HEN1具有甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域，可在體外甲基化miRNA/miRNA*雙鏈，而miRNA的3′末端甲基化可以穩(wěn)定miRNA.大多數(shù)甲基化的miRNA/miRNA*在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HST（HASTY）的幫助下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中[11]。然而在水稻中這些蛋白的功能尚未清楚。

2 水稻miRNA的功能研究

2.1 miRNA參與水稻發(fā)育調(diào)控

Chris A Helliwell等[12]研究小組研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中過表達(dá)miR172能夠延緩水稻開花時(shí)間，從而導(dǎo)致水稻花器官和種子發(fā)育異常，結(jié)實(shí)率低和種子重量下降。深入研究發(fā)現(xiàn)miR172抑制了AP-2家族中SUPERNUMERARY BRACT（SNB）和其他靶基因的表達(dá)。在擬南芥中，miR172的功能已經(jīng)得到了很好的詮釋，miR172控制了開花時(shí)間和花器官的分化。

2.2 miRNA參與逆境脅迫

林鴻宣等[13]研究小組發(fā)現(xiàn)miR169家族的成員都會(huì)受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)，在干旱和高鹽的處理下，檢測(cè)到受處理水稻體內(nèi)miR169表達(dá)普遍上調(diào)。深入研究顯示miRNA169受dehydration-responsive element（DRE）的誘導(dǎo)。與此同時(shí)，miR169n還受到了ABA的上游調(diào)控，影響了NF-YA基因表達(dá)[14]，從而參與水稻抗旱功能表達(dá)。

2.3 miRNA參與激素傳導(dǎo)

吳平等[15]在探索OsSPX基因在耐磷饑餓機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)，OsSPX3能夠調(diào)控miR399的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)OsIPS1能與miR399相互協(xié)作調(diào)控了Os－PHO2，從而在水稻耐低磷中起著重要的作用。此外，該實(shí)驗(yàn)組對(duì)水稻抗生長(zhǎng)素的突變體osaxr的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一些miRNA降低了植株的生長(zhǎng)素敏感性。深入研究發(fā)現(xiàn)，這些miRNA的啟動(dòng)子中存在生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（AuxREs），Yang 等[16]發(fā)現(xiàn)水稻miR167的表達(dá)受生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)上調(diào)，并在轉(zhuǎn)錄后指導(dǎo)對(duì)水稻ARF8的mRNA剪切。miRNA對(duì)水稻不定根的發(fā)育也有著重要的調(diào)節(jié)作用，miR164也在水稻中有著組織上的特異表達(dá)[17-18]。一些miRNA可在受脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和其他植物激素誘導(dǎo)的組織中檢測(cè)到，如 miR159、miR160、miR164 和 miR167。

2.4 miRNA參與抗病毒感染

病毒感染是一個(gè)廣泛影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的生物因素，每年因植物病毒感染而導(dǎo)致大多數(shù)農(nóng)作物和果樹減產(chǎn)30%左右。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)形成了一些抵制病毒感染的機(jī)制，其中一種機(jī)制就是病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。已有越來越多的證據(jù)表明miRNA與病毒介導(dǎo)的疾病以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默有關(guān)。現(xiàn)已從植物病毒中鑒定出的RNA沉默抑制因子有30多種，如p19、p21、p25和p69等，這些抑制因子通常稱為致病因子。致病因子通?？勺璧KsiRNA的形成，或影響siRNA的穩(wěn)定性，或干擾siRNA與RISC復(fù)合物的結(jié)合，并能導(dǎo)致植物的一些相關(guān)疾病的產(chǎn)生和引起發(fā)育畸型。

3 水稻miRNA的鑒定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.1 水稻miRNA的鑒定

加州大學(xué)基因組生物學(xué)研究中心與植物科學(xué)系的朱健康教授等[19-20]從水稻的根、莖、花組織中，構(gòu)建出了3個(gè)miRNA的cDNA文庫。他們已經(jīng)鑒定出35個(gè)miRNA分子，其中有14個(gè)miRNA分子是首次被發(fā)現(xiàn)的，并且證明了13個(gè)全新的miRNA家族。在這14個(gè)首次發(fā)現(xiàn)的miRNA分子中，有13個(gè)在擬南芥基因組中找不到保守區(qū)域。其中4個(gè)與親緣關(guān)系較近的單子葉植物有相關(guān)的保守性。推測(cè)這4個(gè)miRNA分子是單、雙子葉植物分化后進(jìn)化形成的。剩余的9個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA在其他植物的已知序列中尋找不到相似序列。在被檢的水稻組織中，miRNA分子得到廣泛的表達(dá)，盡管有許多miRNA顯示為組織特異性表達(dá)。朱教授對(duì)水稻中全新miRNA的鑒定，說明這些小RNA分子可能在水稻中獨(dú)立演化，而在其他植物中漸漸消沉。

另外，通過非生物的逆境脅迫，研究人員發(fā)現(xiàn)了很多原本表達(dá)豐度不高的miRNA，曹曉風(fēng)等[21]通過構(gòu)建水稻低溫、干旱、高鹽、ABA和對(duì)照的5種cDNA文庫，通過克隆18～26 nt的小RNA并測(cè)序，檢測(cè)到了7種與水稻抗逆相關(guān)的新miRNA。同樣，在對(duì)水稻進(jìn)行重金屬鎘脅迫的時(shí)候也發(fā)現(xiàn)了19種新的miRNA，表明許多miRNA在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答中起著重要的作用[22]。

特拉華大學(xué)的科學(xué)家與美國(guó)國(guó)內(nèi)外的同事合作，發(fā)現(xiàn)了一種新型分子，它可以關(guān)閉水稻的基因[23]。他們發(fā)現(xiàn)的新型分子稱為自然反義微RNA（natmiRNAs），由長(zhǎng)度大約20個(gè)核苷的短小的核糖核酸組成，它們的靶標(biāo)是位于水稻細(xì)胞DNA反向鏈上它們直接面對(duì)的基因。由于天然的堿基互補(bǔ)能夠被Dicer類的RNA酶切割，從而降解靶基因的表達(dá)水平。

3.2 水稻miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將計(jì)算機(jī)分析與實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合使用，使得miRNA的數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。但是尋找已知的miRNA基因的靶位點(diǎn)的工作進(jìn)展并不理想，現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)miRNA所作用的靶基因的功能，而缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因而尋找并分離出靶基因也是一項(xiàng)比較艱巨而重大的工作。

4 miRNA的技術(shù)應(yīng)用

盡管植物miRNA調(diào)控發(fā)育過程的復(fù)雜性和多樣性還沒有完全被解析，但已經(jīng)有報(bào)道成功利用miRNAs進(jìn)行基因工程和基因功能研究的操作。利用人工miRNAs（artificial miRNAs）可以進(jìn)行組織特異性的、可誘導(dǎo)性的、部分基因失活或幾個(gè)序列相關(guān)基因同時(shí)激活的轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)基因沉默。例如構(gòu)建一個(gè)同時(shí)具有3個(gè)不同靶基因（Pds，Spl11和d Eui1/CYP714D1）的人工miRNA載體轉(zhuǎn)入水稻，會(huì)發(fā)現(xiàn)其靶基因的表達(dá)水平都降低了，并且轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)了預(yù)期的表型，能夠穩(wěn)定遺傳[24]。因此人工miRNAs提供了一種新的敲除基因的手段，大大方便了對(duì)目的基因進(jìn)行功能研究。

5 討論

在短短的8 a時(shí)間內(nèi)，植物miRNA的研究取得了突飛猛進(jìn)的成果，它為植物生物學(xué)的研究提出了新的研究思路。水稻作為一種單子葉模式植物和重要的糧食產(chǎn)物，其miRNA成為了當(dāng)今分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。越來越多的植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理被揭示出來，同樣，也出現(xiàn)了越來越多新的問題擺在我們面前。如miRNA對(duì)多個(gè)靶基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控具體機(jī)制是怎樣的，miRNA作用過程中是否有放大效應(yīng)，水稻中究竟有多少miRNA，如何查清楚水稻中的miRNA并找出它們的靶基因和揭示它們的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地進(jìn)行功能研究，從而也才可以弄清楚它在生命活動(dòng)中的作用。雖然目前的研究已經(jīng)揭示出了大量的miRNA，但是其下游的靶基因以及功能的研究并沒有太多的進(jìn)展。水稻miRNA和小RNA的研究還有很長(zhǎng)的路要走。

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