鄧興力, 王應(yīng)莉, 楊智勇, 李向新, 龍 江, 雷德強(qiáng), 劉如恩, 馮忠堂

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常見(jiàn)于中老年的神經(jīng)退行性變性疾病,其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元的變性、缺失其導(dǎo)致紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì) DA的耗竭,目前尚無(wú)根治療法[1～3]。由于 PD病變區(qū)域較為局限,被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞移植治療最有希望治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患之一[4]。本研究擬探討超順磁氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)雙標(biāo)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)基因修飾大鼠胚胎中腦神經(jīng)干細(xì)胞(mesencephalic neural stem cells,mNSCs)移植對(duì) PD大鼠的治療作用,為臨床應(yīng)用細(xì)胞移植治療 PD奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 SPIO、EGFP雙標(biāo)大鼠胚胎 mNSCs的建立[5]

1.2 SPIO、EGFP雙標(biāo) GDNF基因修飾大鼠胚胎 mNSCs的建立[6]

1.3 PD模型大鼠的建立 2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉 SD大鼠,于右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(A/P:-3.6mm;L:+2.0mm;V:-9.0mm)及腹側(cè)被蓋區(qū)(A/P:-6.0mm;L:+0.5mm;V:-8.0mm)分別立體定向注入 12μg 6-OHDA(3μg/μl),注射速度為1μl/min,注射完畢后原位留針 5min,之后緩慢退針(約 2min)。術(shù)后 1w開(kāi)始,腹腔注射阿樸嗎啡(Apomorphine,APO;0.25mg/kg)誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為,每周 1次,連續(xù)測(cè)試 6w。注射 10min后計(jì)數(shù)其在30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。選取平均向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)速度 ＞7rpm的大鼠為建立成功的 PD模型大鼠。

1.4 細(xì)胞移植 選取 36只 PD大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為 3組,每組 12只:(1)對(duì)照組;(2)SPIO、EGFP雙標(biāo) mNSCs移植組 (GFP-NSCs組);(3)SPIO、EGFP雙標(biāo) GDNF基因修飾 mNSCs移植組(GDNF-NSCs組)。細(xì)胞移植前離心收集細(xì)胞,以 PBS重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至 106/ml。2%戊巴比妥鈉麻醉 PD大鼠,將 5×105個(gè)細(xì)胞(5μl)注射于右側(cè)紋狀體(A/P:+0.5mm;L:+3.0 mm;V:-5.0 mm)。細(xì)胞移植后 2w、4w、6w和 8w,腹腔注射 APO誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為,注射 10min后計(jì)數(shù)其在 30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。

1.5 移植細(xì)胞的存活、遷移和分化

1.5.1 MRI動(dòng)態(tài)觀察 細(xì)胞移植后 1w、2w、4w和 8w分別進(jìn)行 MRI掃描。2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,固定于多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作臺(tái)[7],用 Philips Intera 1.5TMRI掃描機(jī)進(jìn)行掃描。采用 5英寸表面線(xiàn)圈,先行三平面定位掃描,然后進(jìn)行梯度回波 T2加權(quán) (T2W/FFE)成像,參數(shù)為 :TR 388ms,TE 23ms,翻轉(zhuǎn)角 18°,FOV 120mm,矩陣 205×256,層厚 2.0mm,掃描時(shí)間 2min 8s。

1.5.2 普魯士藍(lán)染色鑒定 細(xì)胞移植 8w動(dòng)脈灌注固定取大腦標(biāo)本,經(jīng) 4%多聚甲醛后固定、梯度蔗糖處理,于細(xì)胞移植點(diǎn)附近作連續(xù)冠狀冰凍切片(片厚 10μm)。組織切片經(jīng)普魯士藍(lán)染色后,顯微鏡觀察并照相。

1.5.3 熒光顯微鏡觀察 組織切片以抗熒光衰減封片劑直接封片,激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.5.4 免疫熒光組織化學(xué) 組織切片經(jīng) 10%山羊血清封閉,分別與 nestin抗體(1∶1000)、TH抗體(1∶1000)、GFAP抗體(1∶750)孵育過(guò)夜,PBS漂洗后再與 TRITC標(biāo)記 IgG(1∶100)孵育,抗熒光衰減封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.5.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 計(jì)算每只動(dòng)物連續(xù) 5張切片以細(xì)胞移植點(diǎn)為中心100倍視野下GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、nestin與 GFP雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、TH與 GFP雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和 GFAP與 GFP雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析和處理 所有數(shù)據(jù)用 SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,采用單因素方差分析(one-way AVONA)檢驗(yàn),P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 PD模型大鼠的建立 所有動(dòng)物均成功接受腦立體定向手術(shù),無(wú)動(dòng)物死亡。部分大鼠于術(shù)后7～10d開(kāi)始出現(xiàn)頭偏斜、行動(dòng)遲緩、少動(dòng)、尾僵直等異常行為。術(shù)后 2w開(kāi)始,部分大鼠經(jīng) APO誘導(dǎo)可出現(xiàn)向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)行為。隨著時(shí)間推移,經(jīng)APO誘導(dǎo)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)的大鼠數(shù)量明顯增加,且旋轉(zhuǎn)速度較前增快。至術(shù)后 6w,經(jīng)APO誘導(dǎo)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)的大鼠數(shù)量及旋轉(zhuǎn)速度相對(duì)穩(wěn)定,其中 39只大鼠恒定向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)且旋轉(zhuǎn)速度大于 7rpm,視為成功的PD大鼠(見(jiàn)表1)。

表1 術(shù)后APO誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為評(píng)分

2.2 細(xì)胞移植后的行為學(xué)評(píng)估 為方便比較,細(xì)胞移植動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)次數(shù)用相對(duì)值表示:細(xì)胞移植后測(cè)得的旋轉(zhuǎn)次數(shù)/細(xì)胞移植前測(cè)得的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。與對(duì)照組相比,各細(xì)胞移植組 PD大鼠行為學(xué)均有明顯改善,旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少(P＜0.01),以 GDNF-NSCs組最為顯著(見(jiàn)表2)。

2.3 MRI動(dòng)態(tài)觀察 細(xì)胞移植 1w T2W/FFE掃描可見(jiàn)細(xì)胞移植區(qū)呈類(lèi)圓形低信號(hào)影。隨著時(shí)間推移,T2W/FFE成像上低信號(hào)區(qū)域呈逐漸變大的趨勢(shì),但仍局限于細(xì)胞移植區(qū)附近(見(jiàn)圖1)。

2.4 普魯士藍(lán)染色鑒定 普魯士藍(lán)鐵染色示大多數(shù) SPIO標(biāo)記的 mNSCs停留于移植原位,僅少量細(xì)胞向周?chē)X組織遷移(見(jiàn)圖2)。

2.5 熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移,結(jié)果顯示大多數(shù)移植細(xì)胞停留于移植原位,僅少數(shù)細(xì)胞向周?chē)X組織遷移。GDNF-NSCs組存活細(xì)胞數(shù)明顯多于其它各組(見(jiàn)圖3)。

2.6 免疫熒光組織化學(xué) 免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,大多數(shù)移植細(xì)胞停留于移植原位并保持其未分化狀態(tài),部分細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞,僅極少數(shù)細(xì)胞分化為 DA神經(jīng)元。

2.7 細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,GDNF基因修飾 mNSCs移植組 GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和 TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于其它各組;而 GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則明顯低于其它各組 (P＜0.01)(見(jiàn)表3、表4)。

表2 細(xì)胞移植后APO誘導(dǎo)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為評(píng)分

表3 紋狀體區(qū)腦組織切片細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

表4 移植細(xì)胞在紋狀體內(nèi)的分化情況

3 討 論

PD是常見(jiàn)于中老年的神經(jīng)退行性疾病,其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部 DA神經(jīng)元的變性、缺失其導(dǎo)致紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì) DA的耗竭,目前尚無(wú)根治療法[1～3]。隨著近年細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入,神經(jīng)細(xì)胞胞移植技術(shù)已日益引起人們的關(guān)注。由于 PD病變區(qū)域較為局限,被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞移植治療最有希望治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患之一[4]。

由于 6-OHDA對(duì) DA神經(jīng)元具有選擇性損毀作用,故可應(yīng)用其建立 PD動(dòng)物模型[8]。6-OHDA立體定向注射損毀黑質(zhì)-紋狀體 DA通路后,引起大鼠兩側(cè)大腦半球功能不對(duì)稱(chēng)。機(jī)體通過(guò)自我調(diào)節(jié)機(jī)制使損毀側(cè)紋狀體內(nèi) DA受體數(shù)量代償性增加、敏感性增高;而健側(cè)紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì) DA含量、受體的狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)能力均正常。此時(shí)若給予 DA受體激動(dòng)劑,動(dòng)物由于神經(jīng)損毀側(cè)的反應(yīng)強(qiáng)于健側(cè)而無(wú)法保持平衡并向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。APO是突觸后膜多巴胺D2受體激動(dòng)劑,由于旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)主要依賴(lài)于紋狀體背側(cè)中部的 D2受體作用,故其可誘發(fā)大鼠向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為。研究表明,APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為的出現(xiàn)和頻率的大小可作為鑒定模型成功和衡量治療效果的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。故本研究采用 6-OHDA建立 PD大鼠模型,進(jìn)而研究細(xì)胞移植對(duì) PD的治療作用。

GDNF對(duì) DA神經(jīng)元具有特異性的營(yíng)養(yǎng)作用,是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的 DA神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[10]。GDNF的發(fā)現(xiàn)為 PD的治療帶來(lái)突破性進(jìn)展,然而由于血腦屏障和腦組織的解剖特點(diǎn),限制了其應(yīng)用[11～13]。隨著分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因治療為解決 GDNF給藥途徑問(wèn)題帶來(lái)新的希望[14]。作為神經(jīng)組織特異性的前體細(xì)胞,NSCs具有來(lái)源豐富,增殖、分化能力強(qiáng),能整合于宿主細(xì)胞,易于基因修飾,極低或無(wú)免疫源性,無(wú)致瘤性等特點(diǎn),被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的理想載體[15]。最近研究表明,NSCs具有區(qū)域特異性,NSCs的來(lái)源對(duì)其分化神經(jīng)元的最終表型有重要影響[16],源于胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)各區(qū)域的NSCs具有不同的分化潛能,其中 mNSCs更易于分化為 DA神經(jīng)元,是細(xì)胞移植治療 PD的理想細(xì)胞源[17]。本研究顯示,GDNF基因修飾 mNSCs移植可取得較 GFP基因修飾 mNSCs移植更為顯著的療效,說(shuō)明移植入體內(nèi) GDNF基因修飾 mNSCs分泌的 GDNF發(fā)揮了其 DA神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性,阻止了黑質(zhì)-紋狀體局部殘存 DA神經(jīng)元的進(jìn)一步死亡。

為研究 mNSCs在 PD大鼠體內(nèi)的存活和遷徙情況,本研究采用 SPIO和 EGFP基因?qū)?mNSCs進(jìn)行雙標(biāo)記。SPIO是一種新型 MR對(duì)比劑,具有超順磁性,可影響局部磁場(chǎng)的均勻性,同時(shí)產(chǎn)生磁化率效應(yīng),加速共振質(zhì)子的失相位,使 T2弛豫時(shí)間顯著縮短[18]。由于 FFE(GRE)序列對(duì)超順磁性物質(zhì)最為敏感[19],故本研究采用 T2FFE觀察移植的 SPIO標(biāo)記 mNSCs在 PD模型大鼠腦內(nèi)的存活和分布情況。在本研究中,SPIO標(biāo)記 mNSCs移植后,T2FFE顯示移植部位呈低信號(hào)影。GFP基因標(biāo)記技術(shù)是近年迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型細(xì)胞示蹤技術(shù),無(wú)需反應(yīng)底物即可產(chǎn)生綠色熒光,敏感性強(qiáng)且性質(zhì)穩(wěn)定,不干擾細(xì)胞功能,易于檢測(cè),已成為細(xì)胞生物學(xué)研究中廣泛使用的標(biāo)志分子,EGFP是野生型 GFP的突變型,熒光強(qiáng)度增加了 35倍,大大提高了檢測(cè)靈敏度[20]。本研究結(jié)果顯示,EGFP基因標(biāo)記 mNSCs移植 2月后仍然可發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光。

盡管體外研究表明 NSCs具有無(wú)限增殖能力和多向分化潛能,然而其在體內(nèi)的增殖、遷移和分化則受諸多因素的影響[21]。這既包括 NSCs自身的內(nèi)源性因素,還包括生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)、局部微環(huán)境的調(diào)控等外源性因素[22]。由于 mNSCs含有中腦源性轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)發(fā)育信號(hào),能對(duì)區(qū)域性的相關(guān)信號(hào)分子做出快速反應(yīng),故更易于分化為 DA神經(jīng)元[17]。在必需因素的干預(yù)下,僅有 2%～8%體外培養(yǎng)的 mNSCs能夠分化為 DA神經(jīng)元[23～26],然而超過(guò) 10%移植入 PD動(dòng)物體內(nèi)的 mNSCs分化為 DA神經(jīng)元[27,28]。因此,局部微環(huán)境的調(diào)控在 mNSCs向DA神經(jīng)元的分化中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示,移植入 PD大鼠體內(nèi)的 mNSCs均能夠存活并分化為包括 DA神經(jīng)元的多種神經(jīng)細(xì)胞。與 GFP基因修飾 mNSCs移植組相比,GDNF基因修飾 mNSCs移植組中有更多的 mNSCs存活并分化為 DA神經(jīng)元。故 GDNF可改善 PD大鼠紋狀體局部微環(huán)境,使其更有利于移植 mNSCs的存活、生長(zhǎng)并向 DA神經(jīng)元分化。與 Yamasaki等應(yīng)用 NSCs移植治療阿爾茨海默病的研究結(jié)果相似[29],本研究結(jié)果顯示:大多數(shù)移植入 PD大鼠紋狀體內(nèi)的 mNSCs均停留于移植原位,而并未向周?chē)X組織遷移。我們推測(cè),這可能由于 PD大鼠紋狀體局部分泌的細(xì)胞因子致使移植的 mNSCs駐留于移植原位。此外,本研究還發(fā)現(xiàn):PD大鼠紋狀體細(xì)胞移植區(qū)及其周?chē)梢?jiàn)大量 nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性的 GFP陰性細(xì)胞,我們推測(cè)其可能為由紋狀體局部以及移植細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用下自紋狀體或室管膜下區(qū)遷移而來(lái)的內(nèi)源性NSCs[30]。

綜上所述,本研究結(jié)果表明:(1)mNSCs移植可顯著改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙;(2)大多數(shù)移植入 PD大鼠紋狀體內(nèi)的 mNSCs均停留于移植原位;(3)與對(duì)照組相比,GDNF基因修飾 mNSCs移植組中有更多的 mNSCs存活并分化為 DA神經(jīng)元;(4)移植的mNSCs可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)內(nèi)源性 NSCs向細(xì)胞移植區(qū)及其周?chē)w移,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 細(xì)胞移植后的 MRI動(dòng)態(tài)觀察

圖2 紋狀體移植部位的 SPIO標(biāo)記 mNSCs(普魯士藍(lán)染色)A:GFP-NSCs組(×200);B:GDNF-NSCs組(×200)

圖3 熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞在紋狀體內(nèi)的存活及遷移

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