吳新華,朱瑞芝,王 凱,任卓英,牟定榮,魏萬之,繆明明

(1.紅塔煙草(集團)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大學(xué),云南昆明 650224;3.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南長沙 410082; 4.云南煙草科學(xué)研究院,云南昆明 650106)

超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法快速分析煙草中7種潛香物質(zhì)

吳新華1,2,朱瑞芝1,3,王 凱1,3,任卓英1,牟定榮1,魏萬之3,繆明明4

(1.紅塔煙草(集團)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大學(xué),云南昆明 650224;3.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南長沙 410082; 4.云南煙草科學(xué)研究院,云南昆明 650106)

使用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)在多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式下分離鑒定了煙草中7種潛香物質(zhì)。煙樣經(jīng)甲醇提取,XAD-2柱分離純化,選擇中性丟失162 u掃描確定母離子。通過對母離子二級質(zhì)譜掃描(MS2),并根據(jù)m/z192.7、179.2、163.1、134.7、133.2等特征碎片離子峰分析結(jié)果確定了7種潛香型物質(zhì),分別為熊果苷、香豆酸-葡萄糖苷、香豆素奎尼酸、新綠原酸、綠原酸、葡萄糖基阿魏酸、3-氧化紫羅蘭醇葡萄糖苷。

煙草;潛香物質(zhì);超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

Key words:tobacco;aroma precursors;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-MS/MS)

卷煙香吃味是煙草品質(zhì)的重要體現(xiàn),因此對于煙草香味成分的分離、鑒定和分析一直以來都是煙草研究的重要領(lǐng)域。其中潛香物質(zhì)是煙草香氣組成的重要部分,包括有機酸、多酚(主要以葡萄糖苷和酯的形式存在)等。這些化合物在煙葉生長發(fā)育過程中形成,其本身不具有香氣特征,但在煙草成熟、調(diào)制、醇化和燃燒過程中,可釋放出香氣物質(zhì),從而對煙氣香味產(chǎn)生貢獻。潛香物質(zhì)在煙草調(diào)香過程中具有重要作用,對煙草等級、煙氣特征、吸食品位都有重要的影響[1]。

目前對容易獲得標(biāo)樣的潛香物質(zhì)的分析方法主要有液相色譜法[2-4],而對于很難獲得對照品的潛香物質(zhì),如糖苷物質(zhì),其分析方法主要有以下3種:1)先衍生化處理,再使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行分析[5];2)先將糖苷粗提物酶(水)解,然后用氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析糖苷酶(酸)解后的苷元,對糖苷結(jié)合態(tài)香味成分進行定性定量分析[6-8];3)分離純化,結(jié)合核磁分析和氣相色譜進行定性定量分析[9]。以上對于難以獲得標(biāo)樣的糖苷類潛香物質(zhì)的分析方法,均存在前處理復(fù)雜、分析周期長等缺點,本工作通過UPLC-ESI-MS/MS的中性丟失掃描,采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式,分離鑒定煙草中的7種潛香物質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AcquityTM超高效液相色譜儀:美國 Waters公司產(chǎn)品;API 3200 QTrap串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀:美國ABI公司產(chǎn)品;Millipore超純水儀:美國 Millipore公司產(chǎn)品;Branson 3510超聲波發(fā)生儀:Branson公司產(chǎn)品。

甲醇(色譜純):美國Fisher公司產(chǎn)品;水為去離子水;其他有機試劑均為分析純。2007年產(chǎn)玉溪 KC3FG 46-2-3烤煙樣品:由紅塔集團提供。

1.2 樣品處理

1.2.1 潛香物質(zhì)的分離 準(zhǔn)確稱取10 g煙樣(過80目篩)于錐形瓶中,加入100 mL甲醇超聲萃取1 h,萃取液過濾濃縮至干,加入100 mL水溶解過XAD-2柱,先用400 mL水洗去酸、堿和糖等;再用300 mLV(乙醚)∶V(正己烷)= 1∶1的溶液洗去游離香味物質(zhì)和油脂、臘質(zhì)成分;最后用300 mL甲醇洗脫潛香物質(zhì)[9],甲醇洗脫液過0.22μm濾膜,待質(zhì)譜中性丟失掃描分析用。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析樣品 準(zhǔn)確稱取1 g煙樣(過80目篩)于錐形瓶中,加入50 mL甲醇超聲萃取1 h,靜置,取上清液1 mL過0.22 μm有機系濾膜,進行UPLC-MS/MS分析。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

AcquityTMBEH C18色譜柱 (2.1 m × 100 mm×1.7μm);柱溫40℃,樣品室溫度4℃;進樣體積2μL;流動相A為甲醇,B為0.1%乙酸-乙酸銨(10 mmol·L-1)水溶液;流速0.4 mL·min-1;洗脫條件為:0～2 min,由10%A線性變化為100%A,并保持4 min,6～7 min,由100%A臺階梯度變化為10%A。

電噴霧負(fù)離子模式;電噴霧電壓-4 500 V;離子源溫度500℃;離子源輔助氣1,2:4.14× 105Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 潛香物質(zhì)的鑒定

根據(jù)文獻報道[10],以吡喃葡萄糖結(jié)合的糖苷、咖啡酸等物質(zhì)在ESI-MS/MS分析中易產(chǎn)生中性丟失162 u的峰,通過實驗發(fā)現(xiàn),鼠李糖苷除據(jù)文獻報道的丟失碎片峰146 u外,也有丟失162 u的現(xiàn)象,這可能是鼠李糖基和連接苷鍵的O一起丟失而產(chǎn)生的162 u丟失;香豆酸衍生物也有中性丟失162 u,這可能為丟掉香豆酸。本實驗利用質(zhì)譜的中性丟失掃描功能,在優(yōu)化的碰撞能條件下,對經(jīng)過前處理的煙草樣品進行中性丟失162 u的掃描,得到7種潛香型物質(zhì),質(zhì)譜圖示于圖 1。帶負(fù)電荷的母離子分別為:m/z 271.1、325.3、337.1、353.3、355.4、369.0。對分子離子做MS2碎裂分析,全掃描質(zhì)譜圖示于圖2。對于有雜質(zhì)干擾的目標(biāo)物,采用多反應(yīng)監(jiān)測模式同時檢測所有子離子,根據(jù)液相梯度洗脫下各離子的保留時間確定目標(biāo)物碎裂峰和雜質(zhì)碎片峰,其液相色譜圖示于圖3。

圖1 煙樣中性丟失掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Neutral loss scan mass spectrum of tobacco sample

圖2 煙葉中7種潛香物質(zhì)的MS2碎片離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 MS2product ion spectra of 7 aroma precursors in tobacco

分子離子 m/z271.3含有碎片離子 m/z 163.4和133.2,分析為葡萄糖基,苷元離子峰[M—162]-為m/z108.9,結(jié)合文獻[11]判斷為熊果苷,其碎裂為分子離子的糖基丟失—CH2OH,產(chǎn)生碎片離子m/z241.8,熊果苷糖基葡萄糖環(huán)斷裂—CO,產(chǎn)生碎片峰m/z213.0。

分子離子 m/z325.3含有碎片離子 m/z 163.1和133.3,分析為葡萄糖基,苷元離子峰[M—162]-為m/z163.1,結(jié)合文獻[11]判斷為香豆酸-葡萄糖苷。推測其碎裂規(guī)律為:分子離子的糖基丟失—CH2OH,產(chǎn)生碎片離子 m/z 294.9,香豆酸-葡萄糖苷糖基葡萄糖環(huán)斷裂—C2H2O,產(chǎn)生碎片離子 m/z252.8,m/z 118.9是香豆酸丟失—COOH產(chǎn)生的。

圖3 多反應(yīng)監(jiān)測m/z353.3子離子液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram ofm/z353.3 with multiple reaction monitoring

分子離子m/z337.1產(chǎn)生碎片 m/z162.8,但無糖基進一步的裂解碎片 m/z133.1,也無糖基丟失—CH2OH產(chǎn)生碎片峰,排除是糖苷可能,分析 m/z118.9為162.8 u丟失—COOH,判斷為香豆酸,結(jié)合特征峰m/z191.1判斷為香豆素奎尼酸,其碎裂為分子離子先失 H2O產(chǎn)生碎片離子峰m/z321.3,再丟失—COOH產(chǎn)生碎片峰 m/z279.3,香豆酸在丟失—COOH產(chǎn)生m/z118.9碎片后,再丟失末端—C2H2產(chǎn)生碎片離子m/z93.0。

分子離子 m/z353.3的碎片離子主要有m/z134.8,163.1,173.2,176.9,179.0,191.0。通過MRM模式下的液相梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)離子對353.3>134.8,353.3>173.2,353.3>179.0, 353.3>173.2,與文獻報道的新綠原酸和綠原酸的子離子相同[12],保留時間分別為1.33、1.54 min,碎片峰m/z163.1和176.9,其保留時間均為3.37 min,可判斷為雜質(zhì)碎片。推測其碎裂規(guī)律為:母離子斷裂C—O鍵形成咖啡酸碎片離子m/z178.8和奎尼酸碎片離子 m/z190.9 ([M—178.8]-),咖啡酸進一步丟失—COOH產(chǎn)生碎片離子m/z134.8,[M—178.8]-脫水形成碎片離子峰m/z173.2。

分子離子 m/z355.1的碎片離子有 m/z 192.7和134.8,分析為阿魏酸,m/z163.1為阿魏酸丟失 CH3O,m/z134.8為進一步丟失—COOH產(chǎn)生。根據(jù)碎片m/z179.2和163.1,判斷含有糖基,結(jié)合文獻[13]分析為葡萄糖基阿魏酸。

分子離子 m/z369的碎片離子有 m/z 192.9、179.2、163.2、132.9,分析含葡萄糖基,糖基碎片離子峰m/z179丟失與苷鍵連接的O產(chǎn)生碎片 m/z163.2,丟失CH2O產(chǎn)生碎片離子m/z132.9。此外,有 m/z160.9碎片峰分析為糖基丟失—C3H6O2苷元從雙鍵處斷裂丟失—C10H14O產(chǎn)生的。結(jié)合文獻[8]分析為3-氧化紫羅蘭醇葡萄糖苷。

綜上,對煙葉中7種潛香物質(zhì)進行了鑒定,其分析結(jié)果列于表1。

2.2 潛香物質(zhì)的質(zhì)譜碎裂規(guī)律研究

根據(jù)上述裂解碎片離子的結(jié)構(gòu)分析,確定了不同潛香型物質(zhì)特征碎片峰,并總結(jié)其在 ESIMS/MS模式下的碎裂規(guī)律,示于圖4。糖苷物質(zhì)易斷裂糖苷鍵和—CH2OH,形成 m/z163, 133等特征離子峰;香豆酸和咖啡酸易丟失—COOH分別形成 m/z118.9,134.8等特征離子峰;阿魏酸易丟失—CH3O和—COOH形成m/z163.1,134.7等特征離子峰。

表1 煙葉中7種潛香物質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜分析參數(shù)及結(jié)果Table 1 The parameters and results of 7 aroma precursors by UPLC-MS/MS

圖4 潛香型物質(zhì)碎裂規(guī)律Fig.4 The fragmentation of aroma precursors

3 結(jié) 論

建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜法分析煙葉中7種主要潛香型物質(zhì)的方法。使用中性丟失掃描并結(jié)合MS2特征離子峰分析,能快速的確定潛香型物質(zhì)母離子及其碎片離子。

在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,由于樣品中與目標(biāo)物母離子質(zhì)量數(shù)相同的雜質(zhì)很多,采用樣品做MS2掃描會產(chǎn)生很多雜質(zhì)碎片峰,通過對各碎片離子的多反應(yīng)監(jiān)測保留時間的對比,可以有效的排除雜質(zhì)離子,便于碎裂規(guī)律分析,適合復(fù)雜體系未知物結(jié)構(gòu)的研究。

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Rapid Analysis of 7 Aroma Precursors in Tobacco by UPLC-ESI-MS/MS

WU Xin-hua1,2,ZHU Rui-zhi1,3,WANG Kai1,3, REN Zhuo-ying1,MOU Ding-rong1,WEI Wan-zhi3,MIAO Ming-ming4
(1.R&D Center ofHongta Tobacco(Group)Co Ltd,Yuxi653100,China; 2.Kunming University of Science and Technology,Kunming650224,China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan University,Changsha410082,China; 4.Yunnan Academy ofTobacco Science,Kunming650106,China)

A method for identification of 7 aroma precursors in tobacco was established by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-ESI-MS/MS)in the multiple reaction monitoring(MRM) mode.Aroma precursors in tobacco were extracted with methanol,cleaned up with XAD-2 column,then detected and identified by ESI-MS/MS with the neutral loss method.According to the characteristic product ions ofm/z192.7,179.2,163.1,134.7,133.2 acquired by product ion scan(MS2),7 potential flavor compounds are identified,they are arbutin, trans-p-coumaric acid-4-o-β-D-glucopyrannoside,coumaroylquinic acid,neochlorogenic acid,chlorogenic acid,feruloylglycoside,3-oxo-α-ionol-β-D-glycoside.The method is rapid, convenient and suitable for the determination of aroma precursors in tobacco leaves.

O 657.63

A

1004-2997(2010)02-0088-06

2009-08-27;

2009-11-24

吳新華(1984～),男(漢族),湖北監(jiān)利縣人,碩士研究生,從事煙草化學(xué)研究。E-mail:wuxinhuagg@yahoo.com.cn

朱瑞芝(1978～),女(漢族),湖北公安縣人,博士,從事煙草化學(xué)研究。E-mail:zhu.ruizhi@163.com