趙 碩, 崔莉鳳, 申 晴

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

一種快速檢測液態(tài)奶中三聚氰胺的傳感器制備

趙 碩, 崔莉鳳, 申 晴

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

以鄰氨基酚為功能單體,三聚氰胺為模板,鐵氰化鉀為印跡電極和底液間的探針,利用循環(huán)伏安法在金電極上電聚合制備了可快速檢測三聚氰胺的分子印跡聚合物,構(gòu)建了一種有選擇性檢測液態(tài)奶中三聚氰胺的新方法.聚合過程中最優(yōu)反應(yīng)條件分別為,單體/模板的質(zhì)量比為 0.275/ 1,pH值為 5.5,溫度為 30℃,洗脫時間為 6 min.通過示差脈沖法進行檢測,線性范圍為 0.5～7.5 mg/kg.方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.1%～6.4%.測定下限為 0.5mg/kg,分析時間為 6 min.對實際液態(tài)奶樣品進行檢測,其加標(biāo)回收率為 87.5%～109%.該傳感器對三聚氰胺具有良好的敏感度,且樣品無需預(yù)處理,選擇性好,靈敏度高,可用于連續(xù)、自動檢測液態(tài)奶中的三聚氰胺.

三聚氰胺;分子印跡;電聚合;電化學(xué)傳感器

三聚氰胺(Melamine,MAM)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,通常被用作化工原料,但由于三聚氰胺不易被機體代謝,具有腎毒性與致癌作用[1].三聚氰胺的含氮量高達 66.63%,而目前測定牛奶中蛋白質(zhì)的含量是采用食品行業(yè)通行的“凱氏定氮法(Kjeldahlmethod)”,即通過測定食品中氮原子的含量而間接推算的方法[2],無法將蛋白質(zhì)與其他含氮物質(zhì)如三聚氰胺區(qū)分開,因而無法正確判斷食品蛋白質(zhì)含量是否達標(biāo).目前,新頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)[3]中檢測原料乳與乳制品中三聚氰胺方法為高效液相色譜法、液相色譜 -質(zhì)譜/質(zhì)譜法和氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法.雖然該方法的檢測限極低且測量結(jié)果準(zhǔn)確,但由于設(shè)備昂貴,樣品前處理復(fù)雜等限制而不宜普及推廣.因此構(gòu)建一種能對三聚氰胺進行快速檢測的方法具有廣泛的應(yīng)用前景.

最近,周文輝[4]等采用分子印跡技術(shù),以三聚氰胺為模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,合成了對三聚氰胺具有較好選擇性的分子印跡聚合物可以從奶粉、純牛奶等奶制品中選擇性地分離、富集三聚氰胺,并有效地去除奶制品中的復(fù)雜基質(zhì),取得了良好的效果.張紅武[5]在三聚氰胺分子印跡整體柱識別性能的研究中以三聚氰胺為模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑,原位聚合法制備了對MAM有很強選擇性識別能力的分子印跡整體柱,此印跡整體柱有望作為固相萃取柱,在線或離線選擇性富集樣品中的MAM.上述研究主要用于對奶制品中三聚氰胺選擇性地分離.電聚合制備分子印跡傳感器敏感膜用于分析酚類和異丙隆具有一定的報道[6-7].膜的厚度可通過控制流通電荷的多少來進行調(diào)節(jié)[8].Sun等[9]以三聚氰胺為模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,制備了分子印跡材料的離子選擇電極膜.但是目前用電聚合法制備三聚氰胺分子印跡膜傳感器還未見報道.本研究以鄰氨基酚為功能單體,以三聚氰胺為模板分子,構(gòu)建了一種對三聚氰胺具有專一選擇特性的分子印跡電化學(xué)傳感器,并以 K3Fe (CN)6為印跡電極和底液間的探針,實現(xiàn)了對三聚氰胺的快速有效檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AUT070416型電化學(xué)工作站,瑞士萬通中國有限公司;金電極為工作電極(φ=3mm)、鉑電極為對電極和飽和甘汞電極為參比電極,江蘇金壇電分析儀器廠.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品,濟南泰興化工廠;鄰氨基酚AR,北京理工大學(xué)科技開發(fā)公司,鐵氰化鉀AR,北京化工廠;其余試劑均為分析純.

1.2 金電極的處理

金電極在 0.3μm的A12O3粉末上打磨,直至出現(xiàn)光滑的鏡面.用去離子水超聲洗滌5min.然后在K3Fe(CN)6中 -0.1～0.6 V進行循環(huán)伏安法 (CV)掃描直至達到穩(wěn)定.

1.3 分子印跡傳感器敏感膜的制備

金電極為工作電極,鄰氨基酚為功能單體,用0.1moL/L的 HC lO4溶解,用 0.4moL/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值 5.5,加入三聚氰胺 0.2 g.用 CV法電位為-0.2～1.2 V,平衡時間為 10 s.范圍內(nèi)掃描 25圈,掃描速度為 50 mv/s.聚合膜沉積在電極的表面,用去離子水進行超聲洗脫 6min,將模板分子從電極上除去,制成留有模板分子構(gòu)型空穴的分子印跡高分子印跡聚合物薄膜.在同樣條件下,與未加模板分子三聚氰胺時制備的非印跡膜電極進行比較.

1.4 三聚氰胺的檢測

采用三電極裝置:印跡分子傳感器為工作電極,鉑電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極.在室溫條件下,將印跡電極浸入到 5.0 mmol/L K3Fe (CN)6溶液中,當(dāng)背景電流達到穩(wěn)定后,加入三聚氰胺溶液.采用循環(huán)伏安法對印跡傳感器進行電化學(xué)表征.以示差脈沖法對三聚氰胺印跡傳感器的分子印跡效應(yīng)進行定量計算.

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡電聚合過程分析

在電聚合掃描過程中,模板和單體作用,在金電極表面電聚合成分子印跡膜.在初始階段,電極表面能與 K3Fe(CN)6接觸,故有電流響應(yīng),緊接著電聚合膜的形成,阻礙了 K3Fe(CN)6與電極的接觸,故 K3Fe(CN)6在電極表面就沒有峰電流響應(yīng).在有三聚氰胺模板的存在下金電極表面聚合循環(huán)伏安(CV)曲線見圖 1.可以看出,此聚合是一個不可逆過程,隨著循環(huán)伏安掃描次數(shù)的增加,電流強度急劇下降.這是由于在聚合過程中形成了一層致密的不導(dǎo)電的電聚薄膜,從而改變循環(huán)伏安曲線響應(yīng)值.

圖1 印跡電極的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Molecularly imprinted polymer electrode cyclic voltammetry graph

2.2 印跡分子膜電極的電化學(xué)性能

不同性質(zhì)的電極對 K3Fe(CN)6的不同響應(yīng)曲線見圖 2.結(jié)果表明,K3Fe(CN)6在電聚合印跡電極上沒有峰電流出現(xiàn) (b),說明在電極表面生成了完全不導(dǎo)電的聚合膜,但經(jīng)洗脫后出現(xiàn)了低于裸電極的峰電流(c),說明印跡電極得到了洗脫.為了證明洗脫過程中沒有對電聚合膜進行破壞,將洗脫電極在含三聚氰胺的溶液中進行充分印跡后,重新檢測電極對指示劑的示差脈沖響應(yīng),可以看到指示劑的氧化峰又明顯降低,說明制備的印跡電極對三聚氰胺有比較好的印跡能力.

圖2 電極的示差脈沖曲線Fig.2 Differential pulse curve of the electrode

2.3 聚合過程的條件優(yōu)化

用有特殊識別位點的分子印跡膜檢測三聚氰胺,為實驗的最終目的.在聚合和洗脫過程中,用到單體、模板、pH條件以及其它溶劑的用量等,所以本實驗對三聚氰胺分子印跡聚合物膜的制備進行了條件優(yōu)化.

2.3.1 pH值條件的優(yōu)化

對聚合過程中的 pH值分別選取了 3.5,4.5, 5.5,6.5,7.5進行比較.結(jié)果如圖 3,可以看出,印跡后最佳 pH為 5.5.

圖3 pH值優(yōu)化曲線Fig.3 pH optimize curve

2.3.2 單體濃度的優(yōu)化

單體濃度優(yōu)化曲線見圖 4.分析圖 4,單體鄰氨基酚與模板三聚氰胺的質(zhì)量比分別為 0.175∶1, 0.225∶1,0.275∶1,0.325∶1,0.375∶1時的結(jié)果表明,當(dāng)比值為 0.275∶1時,電化學(xué)檢測的三聚氰胺濃度值最大.因此制備電極的單體與模板的質(zhì)量比采用0.275∶1.

圖4 單體濃度值優(yōu)化曲線Fig.4 Monomers concentration optimization curvev

鄰氨基酚在電極表面發(fā)生電聚合形成聚合物膜,用 K3Fe(CN)6作為探針可以觀察到其氧化還原電流有不同程度的降低.說明單體已經(jīng)與模板發(fā)生了聚合反應(yīng),生成的聚合物附著在金電極表面,阻礙了電流的傳導(dǎo).在發(fā)生聚合反應(yīng)的范圍之內(nèi),隨著聚合圈數(shù)的增加,聚合膜層數(shù)在隨之增加.

2.3.3 溫度的條件優(yōu)化

分別選取 22,26,30,34,38℃時的三聚氰胺模板,測濃度作優(yōu)化曲線見圖5.結(jié)果表明溶液溫度值為 30℃時,聚合的三聚氰胺模板濃度值最大.分析原因是三聚氰胺微溶于水,比室溫稍高時三聚氰胺溶解較完全,聚合較充分,易于形成聚合物膜.

2.3.4 模板的條件優(yōu)化

分別加入模板三聚氰胺與單體鄰氨基酚的質(zhì)量比為 0.9∶1,1.8∶1,2.7∶1,3.6∶1,4.5∶1,測濃度作模板優(yōu)化曲線見圖 6.結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者比值為 3.6∶1時,所印跡的三聚氰胺值最大,以后趨于平衡.因此實驗時,采用制備電極的混合液中的三聚氰胺值與鄰氨基酚的比值為 3.6∶1.

圖5 溫度值優(yōu)化曲線Fig.5 Temperature optimize curve

圖6 模板優(yōu)化曲線Fig.6 Melamine concentration optimization curvev

2.3.5 洗脫時間的影響

實驗選取了 5個不同的洗脫時間分別為 2.0, 4.0,6.0,8.0,10.0 min.測濃度作洗脫時間優(yōu)化曲線見圖 7.由實驗數(shù)據(jù)可知,洗脫時間為 6.0 min時,印跡膜已檢測不到三聚氰胺.因此實驗時,采用的洗脫分子印跡聚合膜印跡分子的洗脫時間為 6.0 min.實驗結(jié)果見圖 7.

圖7 洗脫時間的優(yōu)化曲線Fig.7 The optimal elution t ime graph

2.4 三聚氰胺傳感器的性能指標(biāo)

2.4.1 線性范圍

利用制備好的印跡電極對不同濃度三聚氰胺進行檢測,作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖8.加入三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.5,1,2,5,7.5 mg/kg的 5.00 mmol/L鐵氰化鉀溶液進行示差脈沖掃描,記錄峰電流的變化.三聚氰胺濃度的變化與電流的變化在 0.5～7.5 mg/kg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系;相關(guān)系數(shù) R2=0.996 1.

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

圖8 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.8 Standard working curve

最佳實驗條件下制備印跡膜電極及檢測相同濃度值(單體/模板的質(zhì)量比為 0.275/1;分別檢測質(zhì)量濃度為 2 mg/L和 1 mg/L)的三聚氰胺數(shù)據(jù)見表1.檢測相同濃度的三聚氰胺(n=5),計算結(jié)果表明相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 6.45%和 6.13%.

表1 三聚氰胺檢測重復(fù)實驗數(shù)據(jù)Tab.1 Melamine repeated testing experiment data

采用加標(biāo)回收的方法分別對不同種類的實際液態(tài)奶樣品進行檢測,測定結(jié)果見表2.其加標(biāo)回收率分別為 87.5%～109%.

表2 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果Tab.2 Prevented recovery of experimental data

2.4.3 利用三聚氰胺分子印跡傳感器檢測牛奶樣品

分別取北京市某超市購買的液態(tài)奶 20 mL,用制備好的電極檢測其中三聚氰胺的含量,并用其結(jié)果與國家規(guī)定的三聚氰胺限量標(biāo)準(zhǔn) (液態(tài)奶 (包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為 2.5mg/kg)[10]相比較.以表 3中的結(jié)果與國家規(guī)定的三聚氰胺限量標(biāo)準(zhǔn)相比較,樣品 2袋裝純牛奶和樣品 4盒裝純牛奶是超標(biāo)的,其生產(chǎn)日期分別為 2010-07-19和 2010-05-20.

采用三聚氰胺傳感器檢測樣品的結(jié)果見表 3,加標(biāo)回收率為 86.5%～109.8%,與國家標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜法[3]加標(biāo)回收率 80%～110%相比,結(jié)果相近,說明了其檢測結(jié)果的可靠性.

表3 液態(tài)奶樣品中三聚氰胺的檢測結(jié)果Tab.3 Test results ofmelamine ofLiquid milk samples

2.4.4 三聚氰胺傳感器的使用壽命

用連續(xù)洗脫的方法檢測使用壽命,采用示差脈沖法,測峰電流值作傳感器使用壽命圖見圖9.當(dāng)進行到第 31次時,發(fā)現(xiàn)峰電流突然偏高,驗證結(jié)果此時的電極衰減率已經(jīng)達到了 30%以上.

3 結(jié) 論

圖 9 三聚氰胺傳感器的使用壽命圖Fig.9 Using life ofmelamine sensor

本實驗采用電聚合方法制備了用來檢測三聚氰胺的電化學(xué)傳感器.在濃度為 0.5 mg/kg～7.5 mg/ kg時呈良好的線性關(guān)系,并分別對 5種實際液態(tài)奶樣品中三聚氰胺含量進行檢測,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.13%～6.45%;其加標(biāo)回收率為 86.5% ～109.8%,與國標(biāo)法的加標(biāo)回收率基本一致.本方法無需進行預(yù)處理,選擇性好,靈敏度高,簡便經(jīng)濟,為連續(xù)、自動檢測液態(tài)奶中的三聚氰胺提出一種新方法.

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(責(zé)任編輯:鄧清燕)

DETER M INATI ON OFMELAM INE IN L IQUI D M I LK BASED ONMOLECULARLY IMPRINTED ELECTROCHE M I CAL SENSORS

ZHAO Shuo, CU ILi-feng, SHEN Qing
(College of Chem ical and Environm ental Engineering,B eijing Technology and B usiness University,B eijing100048,China)

A molecularly imprinted polymerwasprepared by cyclic voltammetrymethod in gold electrodes usingO-aminophenol as the functionalmonomer,melamine as the template,K3Fe(CN)6as the imprinting electrode and the bottom of liquid probe,based on which a new method for detecting melamine rapidly and selectively in liquid milk was constructed.The opt imum reaction conditions during the polymerization processwere as follows,the ratio of monomers and templates of 0.275∶1,pH 5.5,30℃,and elution t ime of 6 min.The linear range of the method is 0.5～7.5 mg/kg,the relative standard deviation is 6.1%～6.4%,the limit for determination is 0.5mg/kg,and the time for analysis is 6min.The recovery is 87.5%～109%when testing the actual liquid milk samples.Thismethod could be used for detectingmelamine in liquid milk continuously and automaticallywith high selectivity and sensitivity.

melamine;molecular imprinting;electropolymerization;electrochemical sensor

1671-1513(2010)06-0023-05

TS201.6

A

2010-09-28

北京市自然科學(xué)基金資助項目(2102015).

趙 碩(1980—),女,河北石家莊人,碩士研究生,研究方向為水環(huán)境分析;

崔莉鳳(1956—),女,河北唐山人,教授,主要從事環(huán)境監(jiān)測與評價的研究.通訊作者.