羅 祎,宋 洋,薛曉晶,舒翠莉,田世民,仲維科

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心,北京100123; 2.愛德士緬因生物制品貿(mào)易(上海)有限公司,上海200336)

原料乳中三聚氰胺和β-內(nèi)酰胺酶檢測快速篩選法與確證方法比對研究

羅 祎1,宋 洋1,薛曉晶1,舒翠莉2,田世民1,仲維科1

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心,北京100123; 2.愛德士緬因生物制品貿(mào)易(上海)有限公司,上海200336)

目的 對原料乳中三聚氰胺檢測的液質(zhì)確證方法與快速篩選方法進(jìn)行比對驗證。方法 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法快速檢測還原乳中的三聚氰胺。結(jié)果 其最低檢出限達(dá)到0.10 mg/kg,還原乳中三聚氰胺濃度與SNAP讀數(shù)儀讀數(shù)呈顯著正相關(guān)(r2=0.986)。同時通過對原料乳中β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)試樣的比對快速篩選方法與微生物法(杯碟法)完全相符,且二者最低檢出限均可達(dá)到0.000 25 IU/mL。結(jié)論 雙流向酶聯(lián)免疫法可以用于原料乳中非法添加的三聚氰胺和β-內(nèi)酰胺酶的快速篩選,其檢測速度和靈敏度均能滿足奶戶、奶站、乳品廠和部分實驗室的快速篩選檢測,但是其使用目前還僅限于原料乳或原料乳粉。

三聚氰胺;β-內(nèi)酰胺酶;檢測方法

為保障消費者的身體健康,保持乳品行業(yè)的健康發(fā)展,建立牛乳制品中三聚氰胺、β-內(nèi)酰胺酶的快速、準(zhǔn)確和行之有效的檢測方法是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料 藤黃微球菌(micrococcus luteus)CMCC(B)28001 (購自國家醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心),在營養(yǎng)瓊脂上傳代培養(yǎng)備用。實驗用10 U青霉素藥敏紙片(購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司);乙酸、乙酸銨等(購自北京試劑公司);舒巴坦、青霉素G(購自中國藥品生物制品檢定所);β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品(1 k IU)(購自Sigma公司);三聚氰胺、β-內(nèi)酰胺酶SNAP雙流向酶聯(lián)免疫試劑盒[購自愛德士緬因生物制品貿(mào)易(上海)有限公司]。

1.2 儀器 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(LC-M S/M S)(Agilent 6410);SNAP加熱器(北京安普公司);SNAPDSR讀數(shù)儀[愛德士緬因生物制品貿(mào)易(上海)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 還原乳配制 稱取235.3 g工業(yè)奶粉(經(jīng)LC-MS/MS確證為無三聚氰胺,無β-內(nèi)酰胺),溶解于2 000 mL溫水中;三聚氰胺還原乳試樣的配制:取100 mg/kg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)保存液(本實驗室配制并經(jīng)LC-M S/M S確認(rèn)濃度為100 mg/kg)各0、0.1、0.3、1、2、2.5 m L,分別加入100 mL還原乳中,配制為各含0.0、0.1、0.3、1.0、2.0、2.5 mg/kg的還原乳試樣。β-內(nèi)酰胺酶還原乳試樣的配制:將Sigma的青霉素酶1 k IU溶于1 m L緩沖液中(0.1 mol/L Tris HCl,p H 7.0,含有0.1% BSA)得到1 000 IU/mL的青霉素酶。取10 L 1 000 IU/mL的青霉素酶加入1 m L還原乳中配制成10 IU/mL的青霉素酶,再取10 L 1 000 IU/m L的青霉素酶加入1 mL還原乳中配制成0.1 IU/mL的青霉素酶;取0.1 IU/mL的青霉素酶各0、0.25、0.5、1 mL,分別加入100 mL還原乳中,配制為各含0、0.000 25、0.000 5、0.001 IU/mL的還原乳試樣。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測還原乳中三聚氰胺含量,參照GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法。

1.3.3 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法快速檢測還原乳中的三聚氰胺 按試劑盒說明書操作,用配套吸管吸取45 050 L待檢奶樣滴入裝有凍干試劑的試管中,充分晃動混勻,在預(yù)熱到(45± 5)℃的加熱器上孵育樣品2 min,將樣品管中的所有液體倒入SNAP樣品孔中后。倒入的樣品孔中的樣品會流向藍(lán)色的激活圈。當(dāng)藍(lán)色的激活圈開始消失時,快速而有力的壓下操作鍵直至其與SNAP盒體齊平。當(dāng)操作正確時會聽到清晰的“啪”的聲音。保溫至少7 min。讀數(shù)儀讀數(shù)大于1.05為陰性;讀數(shù)儀讀數(shù)小于1.05為陽性。

1.3.4 杯碟法檢測還原乳中β-內(nèi)酰胺酶

1.3.4.1 加樣 取待檢還原乳樣品,按表1順序加入終濃度為0.5 g/mL青霉素G、25 g/mL舒巴坦和0.5 IU/L的陽性對照用β-內(nèi)酰胺酶,并將表1中A～D試樣各200μL放置于加有藤黃微球菌的同一抗生素檢測用培養(yǎng)基上的4個8 mm鋼管中,37℃培養(yǎng)18～22 h,測量抑菌圈直徑。每個試樣重復(fù)測試3遍后取平均值,同時做牛奶試樣的空白對照、25 g/mL舒巴坦對照,見表1。

1.3.4.2 牛奶試樣中β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果判定 (1)如果待檢還原乳試樣空白對照在加有藤黃微球菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基上出現(xiàn)抑菌圈,說明該試樣中含有抗菌物質(zhì)。(2)25μg/ mL舒巴坦對0.5 g/mL青霉素G的抑菌作用沒有影響;同時25 g/m L舒巴坦可有效抑制0.5 IU/Lβ-內(nèi)酰胺酶陽性對照樣品對0.5 g/mL青霉素G的分解作用。(3)在待檢還原乳試樣中,如果添加0.5 g/mL青霉素G的抑菌圈與添加0.5 g/mL青霉素G和25 g/mL舒巴坦試樣的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復(fù)性良好,應(yīng)判定該試樣添加有內(nèi)酰胺酶。(4)在待檢還原乳試樣中,如果添加0.5 g/mL青霉素G試樣的抑菌圈與添加0.5 g/m L青霉素G和25 g/mL舒巴坦試樣的抑菌圈差異在3 mm以下(不含3 mm),且重復(fù)性良好,應(yīng)判定在該試樣品未檢出β-內(nèi)酰胺酶。(5)經(jīng)測試,本方法在牛奶試樣中對β-內(nèi)酰胺酶的檢出限為0.5 IU/L。

表1 杯碟法加樣方法

1.3.5 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接法快速檢測還原乳中的β-內(nèi)酰胺酶 按試劑盒說明書操作將1 m L或1.5 mL待檢還原乳奶樣加入β-內(nèi)酰胺酶檢測試劑瓶中,充分混勻溶解試劑瓶中的干燥粉劑。將加入樣品后的β-內(nèi)酰胺酶試劑瓶置于加熱器上(45±5)℃、(113±9)°F孵育20 min,然后于室溫下放置10 min,β-內(nèi)酰胺酶SNAP操作步驟進(jìn)行檢測。用配套吸管吸取(450±50)μL試劑瓶中奶樣滴入裝有凍干試劑的試管中,充分晃動混勻,在預(yù)熱到(45±5)℃的加熱器上孵育樣品5 min,將樣品管中的所有液體倒入SNAP樣品孔中后。倒入的樣品孔中的樣品會流向藍(lán)色的激活圈。當(dāng)藍(lán)色的激活圈開始消失時,快速而有力的壓下操作鍵直至其與SNAP盒體齊平。當(dāng)操作正確時會聽到清晰的“啪”的聲音。保溫至少4 min。讀數(shù)儀讀數(shù)大于1.05為β-內(nèi)酰胺酶陰性;讀數(shù)儀讀數(shù)小于或等于1.05為β-內(nèi)酰胺酶陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。

2 結(jié) 果

2.1 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測還原乳中三聚氰胺含量 該方法檢出限為0.01 mg/kg,經(jīng)確認(rèn)所配置的含三聚氰胺還原乳試樣中三聚氰胺實際濃度分別為0.00、0.10、0.27、0.89、1.72 mg/kg和2.37 mg/kg。

2.2 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法快速檢測還原乳中的三聚氰胺還原乳中不含三聚氰胺時,20次SNAP檢測讀數(shù)均小于1.05,均為陰性結(jié)果;當(dāng)還原乳中含有0.10 mg/kg的三聚氰胺時,20次SNAP檢測均小于1.05為陰性結(jié)果,但讀數(shù)均較不含三聚氰胺組明顯增加,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);當(dāng)還原乳中含有0.27、0.89、1.72、2.37 mg/kg的三聚氰胺時,20次SNAP檢測讀數(shù)均大于1.05全部為陽性結(jié)果,與不含三聚氰胺組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2;另外,0.00、0.10、0.27、0.89、1.72、2.37 mg/kg各組間的讀數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。還原乳中三聚氰胺濃度與SNAP讀數(shù)儀讀數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系,見圖1。

表2 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法快速檢測還原乳中的三聚氰胺(mg/kg)

圖1 三聚氰胺濃度與SNAP讀數(shù)儀讀數(shù)

2.3 杯碟法檢測還原乳中β-內(nèi)酰胺酶 經(jīng)杯碟法檢測表明所配制的各含0.000 25、0.000 5、0.001 IU/m Lβ-內(nèi)酰胺酶的還原乳試樣均為β-內(nèi)酰胺酶陽性檢出,見封2圖2。

2.4 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接法快速檢測還原乳中的β-內(nèi)酰胺酶 還原乳中0 IU/mLβ-內(nèi)酰胺酶時,15次SNAP檢測讀數(shù)均大于1.05,均為陰性結(jié)果;當(dāng)還原乳中含有0.000 25 IU/mLβ-內(nèi)酰胺酶時,15次SNAP檢測中6次讀數(shù)大于1.05為陰性,9次讀數(shù)小于1.05為陽性;當(dāng)還原乳中含有0.000 5 IU/mL和0.001 IU/mLβ-內(nèi)酰胺酶時,各組的15次SNAP檢測讀數(shù)均小于1.05,均為陽性結(jié)果,見表3。

表3 SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接法快速檢測還原乳中的β-內(nèi)酰胺酶

3 討 論

3.1 2008年10月8日,中國衛(wèi)生部等5個部門聯(lián)合發(fā)布公告,制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值:要求嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg。在三鹿嬰幼兒奶粉事件發(fā)生后,國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會制定了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法3種方法為三聚氰胺的檢測方法,檢測定量限分別為2、0.05和0.01 mg/kg。上述方法均為定量的確證方法,其可以普遍使用于各類檢測實驗室,對于奶戶、奶站、乳品廠和不具備大型檢測儀器的實驗室可以選用適宜的快速篩選方法。通過本次實驗驗證,SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法快速檢測還原乳中的三聚氰胺,當(dāng)還原乳中三聚氰胺濃度達(dá)到0.27 mg/kg時, SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法能夠檢出所有陽性樣品,其最低檢出限能夠達(dá)到0.10 mg/kg,符合目前大部分乳品廠對原料奶三聚氰胺含量在0.3 mg/kg以下的控制要求,還原乳中三聚氰胺濃度與SNAP讀數(shù)儀讀數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r2=0.986)。因此,采用篩選方法檢測乳品中三聚氰胺,當(dāng)檢到陽性或可疑樣品后,再用液相/質(zhì)譜或氣相/質(zhì)譜方法確認(rèn),從而節(jié)約大量的時間和人力。

3.2 目前國際上尚無牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,而市面上的抗生素分解劑原液中的β-內(nèi)酰胺酶濃度均在每毫升微克級[1],而其推薦在牛奶中1∶1 000 000稀釋使用,這一低使用濃度限制了β-內(nèi)酰胺酶直接檢測方法的使用,如酶聯(lián)免疫方法、高效液相色譜法及蛋白雜交等方法。盡管多種微生物可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,但到目前為止還沒有在無人為添加β-內(nèi)酰胺酶的牛奶中檢出β-內(nèi)酰胺酶的報道[2]。究其原因可能是由于采奶方式、牛奶的組分、消毒方法和包裝儲存方法等不適于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶微生物的生存,基于目前已有的知識,應(yīng)認(rèn)為牛奶中檢出的β-內(nèi)酰胺酶是人為添加的。為了應(yīng)對這一特殊情況的出現(xiàn),本實驗室按衛(wèi)生部推薦的微生物法(即杯碟法)檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶,經(jīng)長時間的反復(fù)摸索實驗條件和驗證,最終建立了穩(wěn)定、可靠的β-內(nèi)酰胺酶微生物法(杯碟法)檢測方法,最低檢出限達(dá)到0.000 25 IU/mL,靈敏度為0.000 5 IU/ m L。該方法可用于確認(rèn)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的存在。同時SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接法快速檢測還原乳中的β-內(nèi)酰胺酶,并平行比較微生物(杯碟法)和SNAP間接法的精確度和靈敏度,結(jié)果表明二者的檢出下限均可達(dá)到0.000 25 IU/mL。因此采用快速篩選法進(jìn)行篩選,陽性或可疑樣品再使用微生物(杯碟法)進(jìn)一步確認(rèn)。

[1]崔生輝,李景云,馬越,等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2007,19(2):113.

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10.3969/j.issn.1671-8348.2010.21.053

R446.61;R155.57

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2010-03-24)