吳銀平,袁發(fā)煥,侯衛(wèi)平

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎病科,重慶400037)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是體內(nèi)最有效的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),它不僅參與抗原的攝取及提呈,而且可誘導(dǎo)免疫耐受。目前研究發(fā)現(xiàn)DC的免疫應(yīng)答還是誘導(dǎo)免疫耐受效應(yīng)均取決于DC的成熟狀態(tài):成熟DC表面高表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子CD80、CD86,因而可誘導(dǎo)CD4+Th0分化為 Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答;而未成熟DC(immature DC,imDC)表面低表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子CD80、CD86,可誘導(dǎo)CD4+Th0分化為 Th2細(xì)胞而具有誘導(dǎo)建立外周免疫耐受的特性[1]。Th2細(xì)胞分泌高水平的IL-4可間接促進(jìn)DC的成熟,γ-干擾素(IFN-γ)則能抵抗 IL-4的效應(yīng)。在外周器官組織中,DC是以一種不成熟的狀態(tài)存在,可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulate T cell,Treg)產(chǎn)生分泌具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的IL-10,參與外周免疫耐受的建立。Kitchen等[2]研究發(fā)現(xiàn)在IFN-γ基因敲除鼠可誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的抗-GBM 腎炎,表現(xiàn)為抗原特異性T細(xì)胞的高度激活和增殖,提示由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IFN-γ直接調(diào)控誘導(dǎo)免疫耐受的效應(yīng)。新近研究還發(fā)現(xiàn)IFN-γ具有相矛盾的作用[3],既有可能引發(fā)Th1驅(qū)使的免疫應(yīng)答反應(yīng),又可誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞控制免疫反應(yīng)[3],這種早期產(chǎn)生的IFN-γ能直接抑制具有IFNgR1和IFNgR2的T細(xì)胞,而且還可間接地預(yù)防T細(xì)胞的進(jìn)一步激活。

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合IFN-γ和imDC誘導(dǎo)免疫耐受特性,在體外通過IFN-γ刺激培養(yǎng)imDC與脾臟分離的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),觀察淋巴細(xì)胞增殖及凋亡情況及CD4+T細(xì)胞Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(體質(zhì)量 200～250 g)購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心。大鼠重組IFN-γ、GM-CSF、IL-4(美國 R&D公司),熒光抗體 FITC-anti-rat MHCⅡ、FITC-anti-rat CD86、PE-anti-rat OX62、PE-anti-rat CD80 及同型對照抗體(eBioscience公司),噻唑藍(lán)(MTT,Amersha公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司),胎牛血清((FCS,杭州四季青公司)二甲基亞砜(DMSO,Sigma公司),IL-4、IL-13、IFN-γELISA試劑盒(美國 R&D公司),T細(xì)胞表位 pCol(28-40)多肽(上海英駿生物公司)等。

1.2 大鼠骨髓來源imDC制備 參照Son等[4]的方法,頸椎脫臼處死大鼠,70%乙醇浸泡消毒15 min。無菌取出股骨和脛骨,用鑷子固定長骨后剪刀剪去骨兩端,用RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中,直至骨變白。用200目尼龍網(wǎng)過濾去除小碎骨片和肌肉組織。濾液以4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液。Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞,室溫孵育 2～3 min,4℃、1 000 r/min離心 5 min,棄上清液。洗滌 2遍后,用 24 mL DC培養(yǎng)液(RPMI-1640加rGM-CSF 10 ng/mL+rIL-4 5 ng/m L)重懸細(xì)胞沉淀后,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。輕輕吸出懸浮和半貼壁細(xì)胞,4℃、1 000 r/min離心5 min棄上清液。DC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀,計數(shù)并調(diào)整密度為1×106/mL,加入24孔板中培養(yǎng)(1 mL/孔)。置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48小時新配制DC培養(yǎng)液半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天收集、計數(shù)、用滅菌PBS調(diào)整DC濃度至1×106/m L,即為imDC。

1.3 IFN-γ刺激培養(yǎng)的大鼠骨髓來源未成熟樹突狀細(xì)胞(im-DCIFN-γ)制備 DC取材方法同上,DC孵育3 h,轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)18 h后加IFN-γ(100 U/mL)刺激培養(yǎng)細(xì)胞[5],37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48小時新配制的DC培養(yǎng)液半量換液,并補(bǔ)充IFN-γ(50 U/mL),置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天用滅菌0.01MPBS洗2次,洗去IFN-γ,調(diào)整DC濃度至1×106/m L,補(bǔ)充外源性抗原 T細(xì)胞表位pCol(28-40)多肽,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集、計數(shù)、用滅菌PBS調(diào)整DC濃度至1×106/mL,即為imDCIFN-γ。

1.4 流式細(xì)胞檢測 imDC和imDCIFN-γ表型 分別收集imDC和imDCIFN-γ入刻度離心管,4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入1 mL PBS重懸,計數(shù),分裝入每管約1×106個細(xì)胞于EP管中。4℃、1 000 r/min離心 5 min。棄上清液,再用PBS洗3次,最后用200μL PBS重懸。然后按試劑說明書加入熒光標(biāo)記抗體:PE-anti-rat CD80(1μL)、FITC-anti-ratCD86(1μL)、FITC-anti-rat MHC Ⅱ(1μL)和PE-anti-rat OX62(10 μL),4℃避光孵育30 min。Staining buffer洗滌3次,流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 分離脾臟淋巴細(xì)胞 無菌條件下取脾組織,于200目鋼絲濾網(wǎng)上研磨成勻漿狀,用含2%胎牛血清的無菌生理鹽水沖入無菌平皿制成懸液,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,加5 mL Tris-NH4Cl,靜置 2～3 min去除紅細(xì)胞,加無菌生理鹽水5～6 mL中和,1 200 r/min離心5 min,洗滌 3遍,加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液,嚴(yán)格按說明書提取白膜層細(xì)胞。光鏡下計數(shù)后,用含10%新生牛血清的RPMI-1640調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×106/mL,備用。

1.6 imDC和imDCIFN-γ與脾細(xì)胞鋪板培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分組:(1)對照組,加入含血清RPMI-1640;(2)imDC組,加入培養(yǎng)的im-DC;(3)imDCIFN-γ組,加入imDCIFN-γ。取上述脾細(xì)胞中一部分,鋪24孔板培養(yǎng),每孔0.5 mL,各孔加入制備好的imDC和im-DCIFN-γ各 0.5 mL,對照組加等量的含血清RPMI-1640,輕輕吹打混勻,置37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個樣本鋪6個復(fù)孔,分別于鋪板后 48、72 h收集上清液,待作相關(guān)細(xì)胞因子測試。

1.7 MTT法檢測各組與淋巴細(xì)胞的增殖情況 (1)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入大鼠分離的脾臟淋巴細(xì)胞各100μL。(2)含血清RPMI-1640,5%CO2、37℃培養(yǎng) 4 h。(3)于培養(yǎng)細(xì)胞中加入:含血清RPMI-1640 200μL(對照組);培養(yǎng)的 imDC 200μL(imDC 組);imDCIFN-γ200μL(imDCIFN-γ組);均設(shè) 6 個復(fù)孔,同時設(shè)空白對照。(4)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。(5)在實(shí)驗(yàn)前4 h每孔加入MTT(5 mg/mL)20μL。(6)輕輕吸去上清液,每孔加入DMSO 150μL,輕輕振蕩10 min。(7)在酶標(biāo)光度計上測光吸收值,測定波長為 490 nm,參考波長為630 nm,所得光吸收值代表相應(yīng)孔細(xì)胞的相對數(shù)量。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測各組淋巴細(xì)胞凋亡的情況 (1)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入分離的大鼠脾臟淋巴細(xì)胞500μL。(2)將含血清RPMI-1640和培養(yǎng)細(xì)胞imDC和imDCIFN-γ加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔500μL,每組設(shè)6個復(fù)孔,同時設(shè)空白對照。(3)含血清RPMI-1640,37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。(4)每天各組隨機(jī)抽取2孔。分別收集各組細(xì)胞入刻度離心管,4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液。分裝入每管約1×106個/m L細(xì)胞于EP管中。4℃、1 000 r/min離心 5 min,棄上清液,再用 PBS洗3次。最后用200μLPBS重懸。按試劑說明書加入熒光標(biāo)記抗體,PE-anti-rat CD4 mAb(10μL),4℃、30 min后洗滌3次,加PBS至500μL。按Anneix-V-Flous試劑盒說明書,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。(5)連續(xù)檢測2 d。

1.9 Th1/Th2型細(xì)胞因子濃度測定 按照 R&D公司ELISA試劑盒說明書操作,測定脾細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ(用鋪板培養(yǎng)后72 h收集之上清液)以及Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13(用鋪板培養(yǎng)后48 h收集之上清液)的含量,在BIO-RAD 680酶標(biāo)儀上讀取結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測DC表型 流式細(xì)胞儀檢測(收集制備的imDC以及 imDCIFN-γ)表面 M HC Ⅱ類分子和共刺激分子CD80、CD86以及DC表面相對特異性標(biāo)記OX62情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),imDC表達(dá)的上述分子分別為20.07%、13.01%、21.38%、14.03%,均明顯低于mDC水平(mDC上述分子表達(dá)水平均在70%以上,數(shù)據(jù)未顯示)。imDCIFN-γ表達(dá)上述分子分別為14.01%、19.79%、15.31%、4.78%,均低 表達(dá)表面 MHC Ⅱ 類分子和共刺激分子 CD80、CD86;與 imDC組相比,除 CD80略高一些,其余均低于imDC組(P＜0.05,n=4),見圖1。

圖1 耐受性DC表面共刺激分子和MHCⅡ類分子的表達(dá)情況

2.2 M TT法檢測各組淋巴細(xì)胞增殖情況 對照組OD值為(0.195 0±0.016 0);imDC組為(0.197 4±0.017);imDCIFN-γ組為(0.083 6±0.012),imDC組、imDCIFN-γ組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,n=5)。

2.3 在體外脾淋巴細(xì)胞與共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡變化 采用流式細(xì)胞儀檢測各組淋巴細(xì)胞凋亡率,imDC組(1.06±0.01)與對照組(0.03±0.01)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,n=5);im-DCIFN-γ組凋亡率為(12.98±0.02),與對照組和imDC組比較均明顯增高(P＜0.05,n=5),見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測體外同等條件下大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡變化

圖3 脾細(xì)胞上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ濃度

2.4 ELISA法檢測體外培養(yǎng)脾細(xì)胞上清液Th1/Th2型細(xì)胞因子 imDC組和imDCIFN-γ組表達(dá) IFN-γ濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,n=5),imDC組表達(dá)IFN-γ濃度與對照組和imDCIFN-γ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,n=5);imDCIFN-γ組表達(dá)IL-4和IL-13高于imDC組,也明顯高于對照組(P＜0.05,n=5),見圖 3。

3 討 論

DC是目前已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的“專職抗原遞呈細(xì)胞”(professional APC)[6]。DC廣泛分布于除腦以外的全身各臟器。在外周DC獲取抗原、遞呈抗原、初始化免疫反應(yīng)或死亡[7-9]。DC經(jīng)歷幾個不同的表型期;各個表型期DC具有不同的功能活性,不同的免疫功能。未成熟DC特點(diǎn)是能夠吞噬外源性抗原(通過胞吞、胞飲或各種受體介導(dǎo)的吞噬作用),處理并將相應(yīng)的肽段結(jié)合到內(nèi)源性MHC分子。由于表面表達(dá)MHC和接觸分子(CD80、CD86)的量較少,從而在抗原識別時提呈抗原而缺乏共刺激分子及細(xì)胞因子的參與介導(dǎo)免疫耐受。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的GM-CSF+IL-4誘導(dǎo)方案,經(jīng)IFN-γ刺激培養(yǎng)的imDC通過外源性抗原T細(xì)胞表位pCol(28-40)多肽培養(yǎng),均低表達(dá)表面分子MHCⅡ類分子及共刺激分子CD80、CD86,同樣低表達(dá)DC表面相對特異性標(biāo)記 OX62,表明經(jīng)IFN-γ刺激培養(yǎng)的imDC對抗原的攝取和提呈能力低,未能激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答,而具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性。

Wood和Bawitzki[3]研究及新近研究發(fā)現(xiàn) IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg控制免疫反應(yīng)。Treg分泌IFN-γ對T細(xì)胞的直接調(diào)控發(fā)揮著誘導(dǎo)免疫耐受的效應(yīng)[10]。有研究認(rèn)為,Th1/Th2的動態(tài)平衡是免疫耐受的關(guān)鍵因素,IFN-γ由Th1分泌,IL-4和IL-13由Th2分泌,Th1向 Th2漂移可能是免疫耐受的形成機(jī)制[11-18]。ELISA檢測脾細(xì)胞上清液中imDC組和imDCIFN-γ組表達(dá)IFN-γ無明顯差異,但均高于對照組,同樣脾細(xì)胞上清液中imDCIFN-γ組表達(dá)IL-4和IL-13高于imDC組,且明顯高于對照組,表明IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生 Treg誘導(dǎo)免疫耐受的效應(yīng),并且Th1向Th2漂移,可能誘導(dǎo)形成免疫耐受。

imDC在經(jīng)IFN-γ刺激培養(yǎng)后對外源性抗原的攝取和提呈能力差,能夠體外抑制T細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡;同時實(shí)驗(yàn)表明Th1向Th2漂移,可誘導(dǎo)形成免疫耐受。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有待于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,這將為臨床進(jìn)一步研究免疫耐受提供新的思路。

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