宋遠(yuǎn)見,劉紅芝,溫相如,劉永民

(徐州醫(yī)學(xué)院:1.基礎(chǔ)學(xué)院;2.公共教育學(xué)院,江蘇 221004)

缺血性腦損傷常因腦血液循環(huán)障礙所致,患者常表現(xiàn)為猝然昏撲、不省人事或突然發(fā)生口歪眼斜、舌強(qiáng)言蹇、半身不遂、智力障礙等臨床特征。據(jù)報(bào)道,每年約460萬(wàn)人死于腦卒中,其中約86%因缺血所致。因此,積極探索缺血性腦損傷中所涉及關(guān)鍵因子的狀況,具有極其重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。熱休克蛋白72(heat shock proteins72,HSP72)是HSP家族中最重要的成員,也是應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)最多的成員。作為重要的分子伴侶,HSP72能夠結(jié)合各種變性蛋白,以防這些蛋白遭受免疫細(xì)胞的攻擊[1],因此HSP72對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜑榛A(chǔ),研究HSP72 mRNA和HSP72蛋白在缺血再灌注不同時(shí)期的表達(dá)情況,可望為進(jìn)一步探討HSP72在缺血性腦損傷中的作用機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 雄性健康SD大鼠80只,體質(zhì)量為250～300 g,均為清潔級(jí)。將大鼠隨機(jī)均分為甲、乙兩組,甲組用于檢測(cè)HSP72 mRNA的表達(dá),乙組用于檢測(cè)HSP72蛋白的表達(dá)。甲、乙每個(gè)組又分別分為 8組,即假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注30 min組(I/R30 min)、缺血再灌注3 h組(I/R3 h)、缺血再灌注12 h組(I/R12 h)、缺血再灌注1 d組(I/R1 d)、缺血再灌注3 d組(I/R3 d)、缺血再灌注 5 d組(I/R5 d)和缺血再灌注7 d組(I/R7 d),每組5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 腹腔注射20%水合氯醛(300～350 mg/kg)麻醉動(dòng)物后,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并以寬松繩線套住但不結(jié)扎,電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈[2-3]。手術(shù)第2天在動(dòng)物清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,全腦缺血15 min,然后再灌注不同的時(shí)間。缺血時(shí)保持直腸溫度為36.5～37.5℃。假手術(shù)組實(shí)施與實(shí)驗(yàn)組相同的處理,但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

1.2.2 樣品制備和免疫印跡檢測(cè) 甲組參照Nikaido等[4]使用的方法,使用Trizol試劑盒抽提樣品中總RNA,使用 RTPCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè),引物序列為:5′-CCG GAG AGA AGG AGT AAC TTG ATA AG-3′,5′-TGG ATT AGA GGC TTT TCT GGC TC-3′。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照,引物序列為 :5′-TGA ACA CGG CAT TGT AAC CAA C-3′,5′-CAG TGG TACGAT GTA ACC AAC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳,利用Sensiansy凝膠圖像分析軟件進(jìn)行拍照并進(jìn)行電泳圖像分析。以I/R3 h組為基準(zhǔn)(假設(shè)為1),其余各組與之相除所得比值見表1。

表1 海馬CA1區(qū)HSP72 m RNA表達(dá)情況(±s)

表1 海馬CA1區(qū)HSP72 m RNA表達(dá)情況(±s)

檢測(cè)指標(biāo) Sham I/R30 min I/R3 h I/R12 h I/R1 d I/R3 d I/R5 d I/R7 d HSP72 m RNA 0.12±0.12 0.25±0.13 1 1.51±0.23 2.34±0.15 5.66±0.19 3.13±0.24 1.89±0.17

乙組于大鼠快速斷頭取腦后,分離出雙側(cè)海馬CA 1區(qū),置液氮中凍存。下面步驟中的操作均在冰水浴中實(shí)施。由液氮中取出海馬CA1區(qū),注入1.5 mL內(nèi)含蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液,勻漿(10 s×6次)后,800×g離心 10 min,棄去上清液,加入0.6 m L buffer B振蕩搖勻,12 000×g離心10 min,取上清液,按改良Lowry法,用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)蛋白后分裝,置于-80℃冰箱備用。按宋遠(yuǎn)見等[5]的方法,等量蛋白樣品經(jīng)7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3%BSA室溫封閉3 h后加入HSP72一抗,4℃過(guò)夜。用洗滌緩沖液洗膜3遍,加入二抗IgG,37℃孵育2 h,再用洗滌緩沖液洗膜3遍。用NBT/BCIP顯色,雙蒸水沖洗以終止反應(yīng)。結(jié)果用圖像處理儀(Gene Company)分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,所得數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

HSP72 mRNA表達(dá)見表1,HSP72蛋白表達(dá)見圖1。

圖1 海馬CA 1區(qū)HSP72蛋白表達(dá)情況

3 討 論

HSP72是HSP家族中最重要的成員,也是應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)最多的成員。正常情況下,HSP72主要位于細(xì)胞漿中,當(dāng)細(xì)胞遭受感染或氧化應(yīng)激時(shí),HSP72有一部分向細(xì)胞核內(nèi)移位,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn),H2O2和HS(heat shock)等刺激能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞HSP72發(fā)生核移位,核聚集的HSP72能夠與多種核蛋白發(fā)生相互作用,隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng),HSP72又能夠回到細(xì)胞漿中[7]。HSP72中存在一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域即PBD結(jié)構(gòu)域,通過(guò)該結(jié)構(gòu)域HSP72能夠與蛋白激酶C和JNK1、Akt等多種蛋白結(jié)合,進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。另外,該結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)基因重組方法去除,從而影響HSP72的功能,但并不影響HSP72的核移位[8-9]。作為重要的分子伴侶,HSP72能夠結(jié)合各種變性蛋白,以防這些蛋白遭受免疫細(xì)胞的攻擊[10],因此HSP72對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活具有重要意義。

以SD大鼠腦缺血模型為基礎(chǔ)研究HSP72 mRNA和蛋白的表達(dá)時(shí)間窗,是研究缺血性腦損傷中熱休克作用機(jī)制的重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示,HSP72 mRNA和蛋白在假手術(shù)組和缺血再灌注早期沒有表達(dá),從再灌注3 h開始有少許表達(dá),至再灌注3 d表達(dá)量達(dá)到最高峰,隨之漸漸下降。這一結(jié)果初步提供了HSP72 mRNA和蛋白在缺血性腦損傷過(guò)程中表達(dá)的時(shí)間趨勢(shì),可望為進(jìn)一步研究熱休克作用的相關(guān)機(jī)制提供一定的依據(jù)。

[1] Hartl FU.Molecular chaperones in cellular protein folding[J].Nature,1996,381(6583):571.

[2] 宋遠(yuǎn)見,劉紅芝,裴冬生,等.Akt信號(hào)通路介導(dǎo)腦缺氧缺血后豐富環(huán)境對(duì)幼鼠海馬神經(jīng)元的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2009,35(3):299.

[3] 宋遠(yuǎn)見,劉紅芝,裴冬生,等.缺氧缺血性腦損傷后豐富環(huán)境刺激對(duì)大鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(22):2119.

[4] Nikaido H,Tsunoda H,Nishimura Y,et al.Potential role for heat shock protein 72 in antagonizing cerebral vasospasm after rat subarachnoid hemorrhage[J].Circulation,2004,110(13):1839.

[5] 宋遠(yuǎn)見,劉紅芝,裴冬生,等.一氧化氮對(duì)大鼠腦缺血再灌注后 JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(12):1817.

[6] Cowan KJ,Diamond MI,Welch WJ,et al.Polyglutamine protein aggregation and toxicity are linked to the cellular stress response[J].Hum Mol Genet,2003,12(12):1377.

[7] Lee WC,Wen HC,Chang CP,et al.Heat shock protein 72 overexpression protects against hyperthermia,circulatory shock,and cerebral ischemia during heatstroke[J].JAppl Physiol,2006,100(6):2073.

[8] Mariucci G,Tantucci M,Giuditta A,et al.Permanent brainischemia induces marked increments in HSP72 expression and local protein synthesis in synapses of theischemic hemisphere[J].Neurosci Lett,2007,415(1):77.

[9] Gao T,Newton AC.The turn motif is a phosphorylation switch that regulates the binding of HSP70 to protein kinase C[J].JBiol Chem,2002,277(35):31585.

[10]Hartl FU.Molecular chaperones in cellular protein folding[J].Nature,1996,381(6583):571.