ELISA法早期檢測甜菜叢根病毒的初步應用

沙 紅，王燕飛，張立明，李承業(yè)，董心久，索 博

（新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，烏魯木齊830091）

甜菜叢根病 （Rhizomania）是由甜菜多粘菌 （Polymyxa betae）攜帶的甜菜壞死黃脈病毒 （beet necrotic yellow vein virus,BNYVV）侵染甜菜塊根引起的一種土傳病毒病害，1959年在意大利北部首先發(fā)現(xiàn)。甜菜感染此病后，塊根產(chǎn)量將大幅度下降，在中等以上發(fā)病條件下一般減產(chǎn)30%～80%，含糖率降低4～9度，工藝質(zhì)量差，甚至失去加工價值，罹病嚴重時甚至絕產(chǎn)。新疆是我國甜菜的主產(chǎn)區(qū)之一，重茬、迎茬地逐年增加，提高品種抗性已成為品種選育的主要方向之一。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR是目前室內(nèi)檢測的兩種重要的方法，其中利用ELISA能快速準確檢測出生長期植株及土壤帶毒情況，特別是早期幼苗檢測鑒別感病與抗病品種的方法，因其操作簡單、速度快、靈敏度高和數(shù)據(jù)準確而備受關(guān)注。通過本次試驗研究，希望能為抗病品種的選育提供可靠檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）樣品：試驗材料采自新疆農(nóng)業(yè)科學院瑪納斯試驗站甜菜育種基地叢根病人工病圃。2008年5月25日甜菜定苗時隨機選取X15號，X14號，902號，913號，923號5個品種新鮮根、葉各10株，共計50株用于ELISA檢測；并于2008年10月15日病田田間檢測。（2）試劑：酶聯(lián)免疫試劑盒購于美國AC Diagnostics公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

1.2.2 檢測方法 用ELISA檢測的樣品制備：取甜菜塊根0.5g或葉片1g，用樣品提取緩沖液研磨備用。具體實驗步驟：（1）用包被緩沖液稀釋包被抗體（IgG）（500或1000倍，即20mL緩沖液中加入40μL或20mL緩沖液中加入 20μL），在酶標板中每孔加入 200μL；（2）在 37℃下保持 2～4h；（3）用 PBS-Tween 沖洗（可使用洗板機）3次（每次浸泡幾分鐘），將酶標板倒扣在濾紙上，輕敲吸干；（4）在每兩個孔中加入200μL檢測樣品；（5）4℃下放置過夜；（6）重復步驟（3）；（7）加入稀釋后的 IgG-AP；（8）在 37℃下溫育 4h；（9）重復步驟（3）；（10）加入200μL用底物緩沖液新配制的底物（1mg/mL，4-硝基苯磷酸鹽），室溫下30～60min，或延長至理想反應結(jié)果；（11）加入50μL 3M NaOH及時終止反應；（12）觀察結(jié)果：目測或在酶標儀上于405nm下測定吸光值。每個待測樣品每次2井（穴），重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 根樣檢測結(jié)果

在此次試驗中，陽性對照顯黃色，即感病品種應為黃色反應，非感病品種為無色。通過試驗結(jié)果比對分析，認為在試驗所檢測的5個品種中，X14號，902號，913號，923號為抗病品種，X15號為感病品種，這與田間收獲時剝根鑒定基本一致（見表1）。

表1 甜菜叢根病田間與苗期ELISA檢測結(jié)果

2.2 葉樣檢測結(jié)果

從試驗中可以看出用葉片樣品的檢驗結(jié)果與用根樣的一致，根樣的顯色反應更為敏感準確。在試驗材料少時，在利用ELISA檢測甜菜叢根病時甜菜葉片也可以用做檢測的樣品。

3 討論

3.1 ELISA試劑盒較貴，在本試驗中也用自配試劑。使用自配試劑的過程中發(fā)現(xiàn)其試驗結(jié)果顏色反應不穩(wěn)定，因此試驗主要采用試劑盒完成。

3.2 在利用葉片為檢測材料時，加底物緩沖液新配制的底物顯色時間較長，不易把握，時間太久反應易受環(huán)境的影響，因此在實際操作中，應準確把握反應時間，及時終止反應以得到準確的結(jié)果。

3.3 目前我國利用ELISA檢測早期幼苗，鑒別感病與抗病品種的技術(shù)還處于實驗室小規(guī)模試驗階段，與目前叢根病五級目測法相比而言，利用ELISA法檢測結(jié)果僅為抗、感病，不能對品種抗（感）病的程度（級別）加以區(qū)分，對品種抗病性評價不充分。這也是下一步研究工作的一個方面。

[1]李澤，王洪超，吳玉梅，等.利用ELISA和RT-PCR法檢測甜菜叢根病病毒（BNYVV）[J].中國甜菜糖業(yè)，2008（2）：5-7.

[2]金元，楊莉莉，姚華建，等.利用BNYVV CP蛋白研制甜菜壞死黃脈病毒診斷試劑盒[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，1995（2）：82-85.

[3]馮蕾，董平.應用ELISA及ISEM技術(shù)快速檢測甜菜植株及土壤中BNYVV[J].西北農(nóng)業(yè)學報，1995（2）:95-96.

[4]蔡惠珍，孫以楚，張春來.應用ELISA檢測甜菜品種抗BNYVV病毒差異[J].中國糖料，1997（3）:23-25.

[5]楊繼春，秦樹才，閻新元，等.甜菜叢根病的發(fā)生與防治研究概述[J].中國甜菜糖業(yè)，2003（3）:24-31.

[6]高衛(wèi)士，王燕飛，張立明，等.甜菜叢根病目測鑒評方法及實踐[J].中國糖料，2006（1）：41-46.