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      甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

      2010-09-10 10:42:10劉大麗馬龍彪
      中國糖料 2010年4期
      關(guān)鍵詞:甜菜電泳蔗糖

      劉大麗 ,馬龍彪 ,郝 慧

      (1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室,哈爾濱150080;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所,哈爾濱150080)

      甜菜是我國重要的糖料經(jīng)濟(jì)作物之一。甜菜的品質(zhì)主要取決于可溶性糖的含量和種類[1]。蔗糖是甜菜體內(nèi)有機(jī)物運輸?shù)闹饕问剑彩翘妓衔镔A藏和積累的主要形式[2]。在我國北方,甜菜單產(chǎn)不高,塊根蔗糖含量大幅下降,已成為制約我國甜菜糖業(yè)發(fā)展的重要問題。

      植物蔗糖磷酸合成酶 (Sucrose phosphate synthase,SPS,EC=2.4.1.14)在蔗糖合成過程中扮演著重要角色,它主要通過異構(gòu)調(diào)節(jié)和磷酸化修飾在酶水平調(diào)節(jié)蔗糖合成[3]。SPS最初在小麥中被發(fā)現(xiàn)并得到純化[4],隨后在玉米和菠菜中也純化了SPS,它是由分子量為117~138kDa的亞基構(gòu)成的二聚體或四聚體[5]。SPS是一種低豐度蛋白,它能催化UDP-glucose+D-fructose 6-phosphate=UDP+sucrose 6(F)-phosphate反應(yīng),而這種催化蔗糖生成的反應(yīng)由于SPS的內(nèi)在特性事實上又是不可逆的,因此,SPS是蔗糖合成過程中最為關(guān)鍵的酶之一[6,7]。本研究主要利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了甜菜蔗糖磷酸合成酶(BvSPS)基因片段,并對其序列進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析。

      1 材料和方法

      1.1 實驗材料及試劑

      實驗所用的甜菜試管苗由黑龍江省高校重點實驗室提供。pMD18-T載體 (TaKaRa);大腸桿菌DH5α(Keygen);RNA 電泳所需試劑:20×MOPS:8.87%(m/v) MOPS、1.36%(m/v) NaAc、0.744%(m/v) EDTA-2Na,pH=7.0;變性液:Formamide/10×MOPS/Formaldehyde=15/5/8。未特殊注明的試劑均為進(jìn)口分析純。

      1.2 RNA的提取與濃度測定

      實驗利用BIOZOL(BioFlux)試劑提取甜菜總RNA。稱取1g甜菜試管苗幼嫩葉片組織于5mL BIOZOL試劑中,室溫溫育15min;離心;將上層清液中加入1/5體積的氯仿,冰浴15 min;再次離心,將上層清液中加入等體積異丙醇,于-20°C放置30min;離心后,將沉淀于1mL 70%乙醇中洗滌兩次,晾干后,溶于DEPC水中,儲存于-70°C備用。利用紫外分光光度計,分別在OD260和OD280條件下測定RNA的含量和純度,并將樣品的濃度稀釋成1μg/μL備用。取2μg總RNA,加入15.8μL變性液,電泳緩沖液為1×MOPS,經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳,進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量。

      1.3 引物設(shè)計

      根據(jù)甜菜BvSPS基因的序列(Genbank accession no.X81975)信息,利用Primer premier 5.0設(shè)計上游引物(5'-3'):ATG GCG GGA AAT GAT TGG AT;下游引物(5'-3'):TTA AGC TTT GGA GAG TTT TG,擴(kuò)增BvSPS基因的CDS長度為3138bp。擴(kuò)增引物由上海生工合成。

      1.4 RT-PCR

      實驗在12μL的反應(yīng)體系中加入 3μg RNA、10μM Oligo dT以及RNase free H2O于 65°C反應(yīng) 5min,并立即置于冰上;向第一步變性反應(yīng)液中加入5×RT Buffer,20mM dNTPs,10U RNase Inhibiter以及20U的Rever Tra Ace (ToYoBo),總體積為 20μL。 反應(yīng)條件為 42℃ 60min;99°C 5min;4℃ 5min。 所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?PCR 擴(kuò)增:50μL 的反應(yīng)體系中, 分別加入 2μL cDNA 模板,5μL 10×Taq Buffer、4μL 10mM dNTPs、1μL 20μM 上游引物和下游引物,0.5μL rTaq(TaKaRa)。 PCR 擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)變性 5min;94°C(30s),52°C(45s),72°C(3min),30 個循環(huán);最后 72℃延伸 10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物于 1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,并利用 GeneSnap 6.08(f)進(jìn)行檢測。

      1.5 載體構(gòu)建及序列分析

      將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,回收;將pMD18-T載體和BvSPS回收片段按照摩爾比1∶5進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過Amp抗性及藍(lán)白斑篩選出待測陽性克隆。待測陽性克隆經(jīng)過提質(zhì)粒,酶切鑒定,從而進(jìn)一步確定重組子。利用ORF Finder,PSORT(Prediction of Protein Localization Sites),ExPASy等各種生物信息學(xué)軟件,對BvSPS基因的ORF區(qū)域、分子量、等電點等信息進(jìn)行預(yù)測及序列分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 甜菜BvSPS基因CDS全長的獲得

      實驗以甜菜試管苗為材料,利用BIOZOL試劑提取了甜菜總RNA。如圖1A所示,電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下清晰可見,并且,28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍左右,這說明RNA基本上沒有被降解,且無彌散。同時,加樣孔附近沒有雜帶,說明產(chǎn)物中沒有DNA存在;在18S rRNA下方存在一些較為模糊的條帶,這可能是由tRNA,5.8S RNA和5S rRNA組成的遷移較快的條帶。這些結(jié)果都說明了實驗獲得了較高純度和得率的甜菜總RNA。

      以甜菜總RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶成功獲得了cDNAs。通過RT-PCR擴(kuò)增,實驗在3.1kb左右的位置獲得了目的片斷(圖1B)。這與BvSPS基因的CDS全長的大小3.138kb相一致。

      2.2 pMD 18-T-BvSPS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

      將PCR獲得的BvSPS基因片段進(jìn)行回收,與pMD 18-T連接,并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。挑取白斑克隆,提質(zhì)粒。通過對BvSPS基因序列的限制性內(nèi)切酶分析,選取沒有酶切位點的PstI和XbaI以及在1292bp位置上有一個酶切位點的EcoRI來對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖2A);而這3種限制性內(nèi)切酶在T載體上均有一個酶切位點。

      如圖2B所示,經(jīng)過PstI單酶切重組質(zhì)粒,獲得了5.83kb左右的片段,這與T載體(2.69kb)和BvSPS全長(3.14kb)加起來的總長基本一致;同時,利用T載體兩側(cè)的PstI和XbaI酶切位點酶切重組質(zhì)粒,獲得了兩條位于3.14kb和2.69kb左右位置的條帶,分別是BvSPS基因和T載體。為了更進(jìn)一步的確認(rèn)基因的正確性以及目的基因的插入方向,實驗利用EcoRI酶切重組質(zhì)粒,并獲得了3.98kb和1.86kb左右的兩條片段,根據(jù)EcoRI在BvSPS基因內(nèi)部以及T載體上的位置,可以確定BvSPS基因被逆向插入到T載體上。

      2.3 BvSPS基因的序列分析

      根據(jù)BvSPS基因在Genbank中的登錄號X81975,獲得該基因的堿基及其開放讀碼框的氨基酸序列信息(表1)。BvSPS基因的cDNA全長為3138bp,它編碼了1045個氨基酸;通過ExPASy軟件分析,由這些氨基酸所組成的蛋白的分子量為118.18kDa,等電點為6.15;通過PSORT軟件預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞核;該蛋白編碼的甜菜蔗糖磷酸合成酶(EC=2.4.1.14)可以催化UDP-glucose+D-fructose 6-phosphate=UDP+sucrose 6(F)-phosphate反應(yīng),因而對蔗糖合成起著至關(guān)重要的作用。

      表1 BvSPS基因及所編碼蛋白的生物信息

      3 討論

      蔗糖是甜菜根中糖積累的主要形式,是甜菜品質(zhì)形成的重要因子,而甜菜蔗糖磷酸合成酶(BvSPS)在蔗糖代謝中起著重要作用,它的活性直接反映了甜菜體內(nèi)蔗糖合成的能力。通過克隆BvSPS基因,可以進(jìn)一步地將其構(gòu)建于含有強啟動子或根特異表達(dá)啟動子的植物表達(dá)載體上,再重新轉(zhuǎn)化到甜菜體內(nèi),利用密碼子的偏愛性,使其在甜菜體內(nèi)或其貯糖根部更加強效的表達(dá),以期提高甜菜根的含糖量及甜菜品質(zhì)。

      [1]Fiew S,Willenbrend J.Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase in sugar beet plants(Beta vulgaris L.ssp.altisima)[J].J Plant Physiol,1987,131:153-162.

      [2]Farrar J,Pollock C,Gallagher J.Sucrose and the integration of metabolism in vascular plants[J].Plant Sci,2000,154:1-11.

      [3]Huber SC,Huber JL.Role of sucrose phosphate synthase in sucrose metabolism in leaves[J].Plant Physiol.,1992,99:1275-1278.

      [4]Hawker J S.Enzymes concerned with sucrose synthesis and transformations in seeds of maise,broad bean and castor bean[J].Phytochem,1971,10(10):2313-2322.

      [5]Klein R R,Crafts Brandner S J,Salvucci M E.Cloning and developmental expression of the sucrose phosphate synthase gene from spinach[J].Planta,1993,190(4):498-510.

      [6]Lunn J E,Macrae E.New complexities in the synthesis of sucrose[J].Curr Opin Plant Biol,2003,6(3):208-214.

      [7]Cumino A,Curatti L,Giarrocco L,et al.Sucrose metabolism:Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minmal functional domains shuffled during evolution[J].FEBS Lett,2002,517(1-3):19-23.

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