龍牡洗劑抗真菌活性試驗(yàn)

張建平 姜烜星 王濤 胡福福

龍牡洗劑主要成分為:龍膽草 15 g、牡丹皮 15 g、白蘚皮15 g、蛇床子 15 g,蒼耳子 15 g,苦參 15 g,黃柏 15 g、當(dāng)歸 15 g、薏苡仁 15g、薄荷 15 g、地黃 15 g。具有清熱燥濕、抗菌消炎、止痛止癢功效,每次用洗劑洗、泡 20m in以上,應(yīng)用于各種手足癬。本處方的制劑在臨床上使用多年,實(shí)驗(yàn)論證該制劑的抑菌能力、殺菌作用強(qiáng)弱,從而為中藥制劑在臨床上的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 病原菌檢測

1.1.1 配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 取馬鈴薯塊 200～300 g,瓊脂 20g,葡萄糖 20 g,水 1000ml。按規(guī)程配制,然后分裝,滅菌,備用。

1.1.2 刮取患者皮損邊緣的鱗屑或水皰壁,進(jìn)行真菌培養(yǎng),依形態(tài)學(xué)特征區(qū)分菌屬。

1.1.3 培養(yǎng)方法 使用點(diǎn)植法,一點(diǎn)在斜面中央,一點(diǎn)在上1/4處,一點(diǎn)在下 1/4處。培養(yǎng)條件:pH 5.0～7.0,溫度 25℃～28℃,分離鑒定真菌,皮膚癬菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)生不同色素。

2 藥敏試驗(yàn)

2.1 藥敏片法

2.1.1 藥敏片的制備 取新華 1號定性濾紙,用打孔機(jī)打成6mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片 50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中,瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng) 15磅 15～20m in高壓消毒后,放在 37℃溫箱或烘箱中數(shù)天,使完全干燥。

2.1.2 抗菌藥紙片制作 洗劑制備成 1g:1m l規(guī)格備用,在上述含有 50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入 1 g/ml藥液 0.25ml,并翻動紙片,使各紙片充分浸透藥液,翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱,放 37℃溫箱內(nèi)過夜,干燥后即密蓋,置陰暗干燥處存放,有效期 3～6個月。

2.1.3 在超凈臺中,用經(jīng)酒精燈滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物,以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面[3],每個批號的藥物抑菌實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,抑菌結(jié)果為 3次實(shí)驗(yàn)平均值。

2.1.4 質(zhì)控 標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑應(yīng)落在預(yù)期范圍內(nèi),如果超出該范圍,應(yīng)視為失控而予以糾正。抑菌作用大小主要取決于所用提取物的濃度。

表1 藥敏片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 比濁法[4]制備 MH(水解酪蛋白)肉湯培養(yǎng)基,分裝于試管中,每支 5ml,常壓滅菌后加入不同濃度的洗劑,MH肉湯培養(yǎng)基含藥濃度分別為 5、2.5、1.25、0.625 g/100 m l。然后接種制備好的實(shí)驗(yàn)菌液 0.05m l(105 CFU/ml),并以無藥 MH肉湯培養(yǎng)基接種相同菌種作為對照。于 25℃～28℃恒溫箱培養(yǎng) 72h后,在 721型分光光度計(jì) 480 nm測定各處理液的吸光度,計(jì)算細(xì)菌的相對生長率。

2.3 平板培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法[4]洗劑用無菌蒸餾水作一系列倍比稀釋后,分別將不同濃度藥液 2ml加入到 18m l滅菌MH瓊脂培養(yǎng)基中制成平板培養(yǎng)基,冷凝后MH平板培養(yǎng)基含藥濃度分別 為 5、2.5、1.25、0.625 g/100 m l。 取 0.1 m l(105CFU/ml)實(shí)驗(yàn)菌液滴加到MH瓊脂培養(yǎng)基表面,用滅菌的L型玻璃棒涂勻。每種濃度藥物每個菌種接種 3皿,結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)平均值,并以無藥 MH瓊脂培養(yǎng)基接種相同菌種作為對照。置25℃～28℃恒溫培養(yǎng) 72 h后,計(jì)數(shù)各皿菌落數(shù),計(jì)算細(xì)菌相對生長率。

表2 龍牡洗劑對真菌相對生長率的影響

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法、比濁法和稀釋法同時進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)研究。抑菌圈直徑 ＞20mm為極度敏感;抑菌圈直徑在 15～20mm為高敏;抑菌圈直徑在 10～15mm為中敏;抑菌圈直徑 ＜10mm為低敏;無抑菌圈為不敏感(耐藥)。龍牡洗劑抑菌圈直徑平均為 19.4mm,為高敏。

3.2 從表 2可看出,隨著抑菌物濃度的增加,細(xì)菌的生長迅速受到抑制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明洗劑對真菌均有很強(qiáng)的抑制作用。比較兩種培養(yǎng)方式發(fā)現(xiàn),液體培養(yǎng)時,洗劑提取物的抑菌作用較強(qiáng),細(xì)菌生長差,這可能是液體條件下更有利于抑菌物向細(xì)菌細(xì)胞滲透,易于和細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白質(zhì)等相互結(jié)合,破壞了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的完整性,細(xì)胞膜的生理功能受到損害,因而生長受到影響。

3.3 用龍牡洗劑外用治療各類癬病,每次洗、泡二十分鐘以上,使藥物滲透至皮膚角質(zhì)層,從而殺滅寄生在皮膚角質(zhì)層內(nèi)的癬菌,劑型和用法適合藥效的發(fā)揮。

[1]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊.北京:科學(xué)出版社,2000:193-210.

[2]鄭鈞鏞,王光寶.藥品微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù).北京:人民衛(wèi)生出版社,1989:347-356.

[3]李明遠(yuǎn).微生物學(xué)與免疫學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:842,126.

[4]周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測定方法.重慶:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社重慶分社,1987:1236.