郝曜山,杜建中,孫毅

(山西省農業(yè)生物技術研究中心,山西 太原 030031)

近年來,基因工程的蓬勃發(fā)展為花卉品質的基礎研究和育種帶來了全新的思路和途徑。人們將所鐘意的特性的有關外源基因利用各種基因工程手段轉入植物細胞獲得再生植株,以期獲得帶有目的性狀的轉基因花卉新品系[1]。蝴蝶蘭(Phalaenopsis)作為在國內外市場最受歡迎的花卉之一,近年來市場需求持續(xù)上升,世界各國均對蝴蝶蘭的快速繁殖和新品種選育技術進行廣泛、深入的研究[2]。

但由于蘭科植物同單子葉植物一樣對農桿菌侵染不敏感,組織培養(yǎng)也有一定的難度,目前的轉化方法仍多采用粒子轟擊法[3]。筆者在本研究中通過農桿菌侵染類原球莖體,并在侵染前后輔以超聲波及負壓處理,以gus為報告基因,用卡那霉素為篩選壓進行選擇,獲得了轉化株,并初步建立了農桿菌介導轉化蝴蝶蘭的遺傳體系。

1 材料和方法

1.1 受體材料

植物材料為蝴蝶蘭品系ΔB-5,由山西省農科院園藝研究所提供。我們轉化所用的受體材料為其花梗腋芽在2/3MS培養(yǎng)基+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2 g·L-1胰蛋白胨上于(25±3)℃,光照條件不超過2000 lx培養(yǎng)條件下所誘導的類原球莖 (PLB),最好繼代1～2次的材料。

1.2 供體材料

將所提取的質粒pBI121通過熱擊法轉入農桿菌LBA4404中。其中有在植物中篩選基因Nos-NPTⅡ和報告基因35S-gus。供試菌的轉化制備及質粒的提取參考 《植物基因工程》[4]。

1.3 轉化方法及檢測

1.3.1 將附有質粒p BI121的農桿菌在含利福平(50 mg·L-1)和卡那霉素 (50 mg·L-1)的YEP液體培養(yǎng)基中,于28℃震蕩培養(yǎng)過夜,培養(yǎng)至對數期 (OD600=0.3～0.6),后在4000 g·min-1轉速、室溫下離心5 min收集菌體,并將菌體用重懸培養(yǎng)基懸浮 (OD600值在0.5左右),在侵染前向重懸液中加入乙酰丁香酮 (AS)100 μmol·L-1[5];

1.3.2 將PLB浸入無菌水中進行超聲波處理,處理的參數為頻率25 k Hz,強度400 W,時間為100 s;將PLB取出浸沒在預先準備好的菌液中,并在負壓50 k Pa壓力下侵染20 min左右;侵染結束后,用吸水紙快速吸凈PLB上多余的菌液,在超凈工作臺上將侵染過的PLB轉移到繼代培養(yǎng)基上,然后置于200～600 lx弱光照條件下繼續(xù)共培養(yǎng)3～4 d。

1.3.3 將共培養(yǎng)的PLB轉接到含200 mg·L-1頭孢的繼代培養(yǎng)基上,于1000～2000 lx光照下培養(yǎng)30 d后挑選新鮮的PLB轉移到500 mg·L-1卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上,繼代培養(yǎng)2～3代。

1.3.4 對存活的PLB進行gus染色觀察統計[4];并將其接種到含有200 mg·L-1卡那霉素的生根培養(yǎng)基上;60 d后取其葉片進行PCR檢測 (提取DNA的方法為CTAB法,參照 《基因工程學原理》)[1]。

2 結果與分析

2.1 蝴蝶蘭類原球莖繼代培養(yǎng)基條件優(yōu)化

具有高效穩(wěn)定的再生能力的受體材料是蝴蝶蘭遺傳轉化成功的關鍵。由于在轉化過程中的一些處理,如農桿菌侵染、超聲波負壓處理、機械損傷及抗生素的篩選都會使轉化的PLB比非轉化的PLB的再生頻率不同程度的降低[6,7],因此,PLB受體系統必須具有較強的再生能力,只有這樣,轉化的PLB才能進一步脫分化和再分化。將蝴蝶蘭原球莖轉接在設置的培養(yǎng)基上,50 d后調查其生長情況,結果見表1。

由表1可見,當6-BA為3 mg·L-1、NAA為0.5 mg·L-1時,蝴蝶蘭類原球莖具有較好的增殖效果,增殖系數達4.8。

另外,在筆者在研究中發(fā)現,2/3MS培養(yǎng)基+2 g·L-1胰蛋白胨并輔以1000～2000 lx的光照培養(yǎng)條件下所誘導的類原球莖 (PLB)的再生能力較強。含1/3MS培養(yǎng)基+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+胰蛋白胨2 g·L-1+150 g·L-1的香蕉泥有利于蝴蝶蘭原球莖快速生根[8]。

表1 不同激素配比對蝴蝶蘭原球莖增殖的影響 (接種數均為30,其中增殖系數為增殖量/接種數)Table 1 Effects of 6-BA and NAA on proliferation from Phalaenopsis PLB(Inoculant number:30;rate of proliferation=proliferation number/inoculant number)

2.2 農桿菌菌液濃度對轉化的影響

從圖1可以看到蝴蝶蘭類原球莖在被OD600值為0.3菌液侵染后 gus轉化瞬時表達率最高,并在OD600值0.3～0.6之間的菌液侵染后gus轉化瞬時表達率差異不明顯,OD600值0.7之后呈快速下降趨勢。所以我們選用在對數生長期的OD600值為0.3～0.6的農桿菌作為侵染體。

圖1 農桿菌菌液濃度對轉化的影響Fig.1 Effects of different bacterium concentrations onexpression of gus

2.3 超聲波及負壓處理對轉化的影響

將在表2中不同處理的PLB在500 mg·L-1的卡那霉素條件下篩選30 d后進行gus組織化學分析染色。在各個處理中均檢測到 gus的表達,其染色陽性率均達20%以上。而在侵染前進行超聲波預處理,會很大程度上提高轉化效率。若侵染是在負壓下進行,而沒有進行超聲波預處理則轉化效率與對照相比略有提高。另外,我們發(fā)現超聲波預處理和在負壓下侵染二者之間存在交互影響,若同時處理將會更大程度上提高轉化效率。但是我們也發(fā)現,超聲波與負壓處理與對照相比會大大降低PLB的生根與成苗的百分率,如何提高這兩種處理后PLB的生根和成苗率,有待進一步的研究。

表2 不同處理對轉化的影響Table2 Effect of treatment methods on the transformation efficiency

2.4 蝴蝶蘭ΔB-5的PLB對卡那霉素的敏感性

將蝴蝶蘭 ΔB-5的PLB置于含100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1和500 mg·L-1卡那霉素的2/3MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)50～60 d。結果表明,蝴蝶蘭ΔB-5的PLB在卡那霉素濃度達到400 mg·L-1時仍有45%正常存活,在卡那霉素濃度達到500 mg·L-1僅有不到5%的存活率。試驗證明蝴蝶蘭對卡那霉素具有較強的耐受性。固在其后的轉化實驗中,我們選定500 mg·L-1卡那霉素濃度作為篩選濃度,以減少假陽性抗性PLB及嵌合體PLB的獲得。

2.5 轉化植株的PCR檢測結果

處理的249個PLB經過60～90 d的篩選培養(yǎng)后,共獲得69個卡那霉素抗性PLB(包括在篩選壓下新生的PLB),將其轉移至含1/3MS培養(yǎng)基+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+胰蛋白胨2 g·L-1+150 g·L-1香蕉泥+200 mg·L-1的卡那霉素培養(yǎng)基上誘導植株再生,共獲得50株再生蝴蝶蘭 (其中有6株為叢生狀),3～4葉時取其部分頂端葉片提取DNA進行PCR檢測分析。其中有17株呈陽性,在對照植株中未擴增出此條帶 (見圖2)。

3 結論與討論

圖2 部分轉化植株的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR result of CaMV 35S from transformed Phalaenopsis.

目前,轉基因蝴蝶蘭選育大多采用原球莖,類原球莖,或非胚性愈傷組織為試材,采用原球莖,類原球莖作為受體材料雖然繼代培養(yǎng)相對容易,再生能力強,但由于未經過中間的愈傷組織發(fā)生過程,而使得對選擇藥劑有抗性的再生材料所發(fā)育獲得的轉化株多為嵌合體[9];而采用非胚性愈傷組織雖然易獲得完全轉化株,但蝴蝶蘭非胚性愈傷組織在固體培養(yǎng)基上易白化死亡,浸染后存活率較低,且長成植株后其一些好的特性易發(fā)生改變[10]。這都使得蝴蝶蘭的基因轉化不易操作,在本研究中,筆者用蝴蝶蘭品系ΔB-5采用卡那霉素作為篩選元件,對蝴蝶蘭的類原球莖采用多次繼代選擇方法,有效控制了嵌合體的產生。在實驗中,我們在對蝴蝶蘭逐代繼代培養(yǎng)中用GUS檢測中也證實了這種情況。

另外,筆者在試驗中發(fā)現,在農桿菌侵染前使用低頻頻率為25 k Hz,強度為400 W的超聲波對待處理的PLB進行預處理,可以大大提高蝴蝶蘭外源基因的轉化效率。這可能和超聲波的空化作用有關,其有可能使得植物細胞處于一種類似感受態(tài)的狀態(tài),使得農桿菌更易于侵染[11]。而在試驗中侵染時被侵染對象處于負壓狀態(tài),與對照相比其侵染效率稍有提高。其原因可能是因為排除了受體材料表面的微小氣泡,使得菌液與受體材料能夠更充分地接觸,從而增加了對其的侵染機會。試驗中我們也發(fā)現,這兩種處理方式同時使用時會更大程度上提高轉化率,說明兩者之間存在著一定的交互作用,其機理還有待進一步的研究。

蝴蝶蘭作為一種重要的觀賞花卉,建立成熟高效的轉化體系是十分必要的。本研究中通過對農桿菌介導轉化蝴蝶蘭PLB過程中輔以一定強度的超聲波及負壓處理,并最終獲得了轉化株,為進一步提高蝴蝶蘭遺傳轉化體系和導入外源有益基因提供了理論依據。

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