程妮 韓福才 王艷峰 麥羨霞 蘇文

腫瘤免疫編輯學(xué)說[1,2]認為機體的免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間存在著相互作用：免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細胞的抗原性；腫瘤細胞改變免疫效應(yīng)細胞的抗腫瘤效應(yīng)。其中在抗腫瘤免疫中，活化性受體NKG2D為近幾年來研究的熱點之一。它在所有的NK細胞、大多數(shù)NKT細胞、巨噬細胞和γδ+T細胞表面均有表達，另外NKG2D也存在于CD8+T細胞表面[3]。其配體之一是主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)分子A（major histocompatibility complex class I chainrelated A, MICA）。靶細胞表面NKG2D的配體與淋巴細胞表面NKG2D的結(jié)合可以激活淋巴細胞殺傷表達NKG2D配體的腫瘤細胞[4]。因此，NKG2D在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。CD3+CD56+NKT細胞作為一類新的細胞毒性效應(yīng)細胞，兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性廣譜殺瘤作用。但是人們對活化受體NKG2D的認識僅局限于NK細胞及T細胞，該受體在NKT細胞表面的表達情況及其與肺癌臨床生物學(xué)關(guān)系尚不明了。本研究旨在對CD8+NKT細胞表面活化性受體NKG2D在肺癌患者外周血中的表達水平及其臨床意義進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 實驗組選取2009年11月-2010年5月山西省腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的初治肺癌患者82例，年齡43歲-69歲，中位年齡54歲。入選標準為具有完整臨床、病理資料、經(jīng)病理或細胞學(xué)、影像學(xué)檢查確診的肺癌患者，所有患者均無免疫相關(guān)性疾病和其它腫瘤病史，且無使用激素類藥物及免疫抑制劑史。根據(jù)UICC國際TNM標準2009分類，Ia期-IIb期肺癌患者22例，IIIa期-IIIb期肺癌患者28例，IV期肺癌患者32例。根據(jù)病理分型分類，鱗癌45例，腺癌37例（不研究小細胞癌）。對照組來自體檢職工部分志愿者45例，其中男25例，女20例，年齡40歲-67歲，中位年齡52歲。

1.1.2 實驗試劑與儀器 抗CD3-PerCP、抗CD8-PE、抗CD56-FITC、抗NKG2D-APC四種熒光素直接標記的抗體購自美國BD公司；sMICA酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒為德國IMMATRICS Biotechnologies產(chǎn)品；裂解液購自美國Becton Dickinson公司；PBS磷酸鹽緩沖液（pH=7.2-7.4）；Sunrise全自動酶標儀購自奧地利Tacan公司；FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司；KDC-1044低速離心機購自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 方法 采用四色免疫熒光染色（CD3-PerCP/CD8-PE/CD56-FITC/NKG2D-APC）方法檢測受體NKG2D在CD8+NKT細胞表面的表達水平。治療前抽取患者空腹靜脈血2 mL于EDTA鉀鹽抗凝的真空采血管中，輕輕搖勻后備用。取熒光標記的單克隆抗體20 μL加入EP管中，設(shè)相應(yīng)的同型對照，加入EDTA鉀鹽抗凝全血100 μL，充分混勻，室溫避光孵育20 min；同時加入1 mL紅細胞裂解液，混勻后避光孵育10 min，離心7 min（1 500 rpm），棄去上清；加入2 mL PBS洗滌液后離心7 min（1 500 rpm），棄去上清，重復(fù)2次，棄去上清PBS，將洗滌液混勻，流式細胞儀上機檢測，采用Diva軟件分析獲取細胞。sMICA根據(jù)試劑盒提供的操作方法測定，以波長450 nm檢測結(jié)果。測定sMICA水平的樣本獲?。喝§o脈血2 mL-3 mL于無抗凝真空采血管中，待血液凝固后，2 000 rpm，離心10 min，取血清于1.5 mL的EP管中，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行。結(jié)果用Mean±SD表示。各實驗組之間表達水平差異采用獨立樣本t檢驗或One-Way ANOVA進行分析；雙變量相關(guān)性分析根據(jù)變量是否符合正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對照組健康人群與肺癌患者外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D表達情況 與對照組健康人群相比，患者外周血中CD8+NKT細胞受體NKG2D的表達下降（P＜0.001）（表1，圖1）。

2.2 肺癌患者外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D與生物學(xué)特征之間的關(guān)系 與非吸煙患者相比，吸煙患者外周血中CD8+NKT細胞受體NKG2D的表達下降（P＜0.05）。CD8+NKT細胞受體NKG2D的表達與病理類型、性別、年齡無關(guān)（P＞0.05）。隨著TNM分期的增加，NKG2D的表達率逐漸降低。其中IV期肺癌患者NKG2D的表達低于I期-II期及III期患者該受體的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（表2）。

2.3 外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D與sMICA的相關(guān)性經(jīng)線性相關(guān)分析表明，外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D和sMICA呈線性負相關(guān)（r=-0.598, P＜0.001）（圖2）。

表 1 正常人和肺癌患者外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D表達水平Tab 1 NKG2D expression levels in CD8+ NKT cell of normal subjects and lung cancer patients

圖 1 對照組健康人和肺癌患者CD8+NKT細胞受體NKG2D流式細胞散點圖Fig 1 Scatter plots about NKG2D-expressing CD8+NKT cells which was measured by flow cytometry for healthy controls and lung cancer patients

表 2 肺癌患者外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D表達與一般生物學(xué)特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of NKG2D-expressing CD8+NKT cells and biological characteristics of advanced lung cancer patients

圖 2 外周血CD8+NKT細胞表面受體NKG2D與SMICA負性相關(guān)散點圖Fig 2 Scetter Plots about sMICA levers and the number of NKG2D-expressing CD8+NKT cells which are negatively corrected

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)尤其是細胞免疫密切相關(guān)。因此，隨著多學(xué)科治療模式的逐步形成，免疫治療作為繼手術(shù)、化療及放療后第四種腫瘤治療手段受到人們的廣泛重視。自然殺傷性T細胞（natural killer T cell, NKT）是一類在機體早期抗腫瘤免疫機制中起重要作用的效應(yīng)T細胞，作為機體抗腫瘤的第一道防線，其在抵抗腫瘤和病毒感染過程中起關(guān)鍵作用。NKT細胞以CD3+CD56+為生物學(xué)特征。根據(jù)CD4、CD8的表達與否，NKT細胞分為CD4+NKT、CD8+NKT和（CD4-CD8-）DN三個亞群[5]。NKT細胞通過識別由非經(jīng)典的MHC-I類分子（CD1d）遞呈的糖脂類抗原活化并迅速分泌大量TH1和TH2類細胞因子[6,7]。NKG2D是自然殺傷性T細胞重要的激活性受體，它通過識別靶細胞（多為腫瘤細胞）表面的配體MICA，并與之結(jié)合傳遞活化信號，繼而激活免疫效應(yīng)細胞（包括NKT細胞）對靶細胞的殺傷作用。因此NKG2D的表達是機體抗腫瘤免疫的關(guān)鍵因素。sMICA是由于腫瘤細胞的死亡、MICA分泌和金屬蛋白酶水解而脫落至外周血中的MICA。sMICA降低了腫瘤表面MICA分子的表達水平，而且它還能誘導(dǎo)NKT細胞表面和NK細胞表面受體NKG2D發(fā)生內(nèi)化降解，導(dǎo)致NKT細胞和NK細胞NKG2D的下調(diào)，抑制免疫細胞殺傷活性，導(dǎo)致腫瘤逃逸[8]。

CD8+NKT細胞表面表達NKG2D的同時，NK細胞也表達CD56，因此本研究對NKG2D表達的流式細胞結(jié)果進行分析時，選擇CD3+CD56+的細胞群，有效避免了NK細胞（CD3-CD56+）的干擾，確保了實驗結(jié)果的準確性。本研究結(jié)果表明NKG2D發(fā)揮免疫正調(diào)節(jié)作用。Cristina等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者及結(jié)直腸癌患者免疫細胞受腫瘤細胞的編輯，其細胞表面的活化性受體NKG2D表達下降時，NKT細胞的殺傷活性降低；CD8+NKT細胞表面受體NKG2D的表達明顯低于健康對照組，同時其配體sMICA高于健康對照組；外周血sMICA上調(diào)介導(dǎo)的NKT細胞活化受體NKG2D的下調(diào)機制參與了以腫瘤為中心抑制免疫網(wǎng)絡(luò)的形成，與機體免疫狀態(tài)有著密切聯(lián)系，可作為監(jiān)視腫瘤患者免疫功能的參考指標，也可作為評估腫瘤發(fā)生發(fā)展的參考依據(jù)。

肺癌患者細胞免疫處于抑制狀態(tài)，而機體的免疫狀態(tài)與腫瘤的侵襲及演進有關(guān)。NKG2D表達的檢測可作為評價肺癌細胞免疫狀態(tài)的指標，在肺癌免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，與健康對照組人群相比，肺癌患者外周血中CD8+NKT細胞表面NKG2D受體的表達水平較低（P＜0.001）。筆者認為肺癌患者外周血NKT細胞表面受體NKG2D下調(diào)的原因可能是：①血清高表達sMICA誘導(dǎo)了NKT細胞表面的NKG2D發(fā)生內(nèi)化降解[10]；②與腫瘤分泌有關(guān)的一些免疫抑制細胞因子如TGF-β有關(guān)[11]；③可溶性抗原sMICA可作為封閉因子封閉效應(yīng)NKT細胞表面受體NKG2D，阻止NKT細胞的細胞毒作用，由于其結(jié)合位點被占用，因此使用流式細胞儀無法檢測到這部分受體的存在，導(dǎo)致所測NKT細胞表面受體NKG2D水平降低。④肺癌細胞表面脫落的sMICA反過來可以下調(diào)NKG2D受體的表達而產(chǎn)生肺癌免疫逃逸。

腫瘤的免疫治療建立在免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能的基礎(chǔ)上，即免疫系統(tǒng)能夠識別腫瘤細胞并將其殺死。本研究結(jié)果表明，肺癌患者外周血中CD8+NKT細胞表面NKG2D受體的表達較健康人群低（P＜0.001），同時該受體的表達與吸煙、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），且隨著臨床分期的增加，NKG2D的表達逐漸降低。其中I期-II期及III期肺癌患者NKG2D的表達均明顯高于IV期患者該受體的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），但它與肺癌病理分型、年齡及性別無關(guān)（P＞0.05），說明外周血中CD8+NKT細胞表面NKG2D受體與肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。研究同時表明，外周血CD8+NKT細胞受體NKG2D和其配體sMICA呈線性負相關(guān)，間接證實肺癌患者血清sMICA升高介導(dǎo)NKG2D下調(diào)的腫瘤免疫逃逸機制，而其中NKG2D發(fā)揮免疫正調(diào)節(jié)作用。綜上所述可能由于其表面NKG2D受體表達的下降，肺癌患者體內(nèi)NKT細胞對肺癌細胞的反應(yīng)性降低，因此不能對肺癌細胞進行有效地殺傷，同時表面MICA/B配體的表達而逃逸NKT細胞的細胞毒作用。肺癌細胞也可能通過減少其上調(diào)介導(dǎo)NKT細胞活化受體NKG2D下調(diào)機制參與了晚期肺癌以腫瘤為中心抑制免疫網(wǎng)絡(luò)的形成，與機體免疫狀態(tài)有著密切聯(lián)系，可作為監(jiān)視晚期肺癌患者免疫功能的參考指標，也可作為評估肺癌發(fā)生發(fā)展的參考依據(jù)。但以N KG2D-MICA為基礎(chǔ)的免疫監(jiān)視功能在肺癌患者中如何發(fā)揮作用、如何誘導(dǎo)肺癌細胞表面MICA/B的表達、如何減少膜性MIC的脫落以及如何上調(diào)NKG2D的表達以恢復(fù)NKT細胞的活性值得深入研究。