張明雪，曹洪欣，車(chē)紅花，何 偉，顧 平

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700）

本實(shí)驗(yàn)采用新生2d～3d大鼠心肌細(xì)胞建立柯薩奇病毒B3（CVB3）感染模型，通過(guò)改良抑制性消減雜交技術(shù)（SSH），克隆受 CVB3攻擊的宿主細(xì)胞中被中藥（益氣活血中藥復(fù)方）調(diào)控的基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 新生2d～3d wistar大鼠，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品及制備 CVB3m嗜心肌毒株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；益氣活血中藥復(fù)方由黃芪、白參、丹參、郁金、麥冬、白茅根等藥組成，制成含生藥濃度為1g/ml的注射液，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院制備。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 剪取乳鼠心室肌，用預(yù)冷 HBSS液沖洗3遍，剪為1mm3碎塊，0.25％胰蛋白酶，37℃水浴震蕩消化 50min～60min，加適量10％胎牛血清中止消化，1000r/min離心10min棄上清液，加入8ml HBSS液洗滌細(xì)胞，1000r/min離心10min棄上清液，加入含10％胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液混勻細(xì)胞沉淀，過(guò)200目濾網(wǎng)，經(jīng)60mm培養(yǎng)皿純化1.5h后，將細(xì)胞分為2組，1組為病毒感染組，1組為病毒感染加益氣活血中藥復(fù)方組，于5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 CVB3病毒性心肌炎模型的建立［1～3］培養(yǎng)72h后，在已呈規(guī)律同步搏動(dòng)的2組各瓶細(xì)胞中，分別加入含CVB3（在HeLa細(xì)胞上滴定CVB3病毒毒力為 10－8TCID50）的 1640生長(zhǎng)液 1ml，吸附1.5h后一組加入10％胎牛血清1ml為 tester；另一組加以1∶16的10％胎牛血清稀釋的益氣活血中藥復(fù)方1ml為 driver，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，吸出各培養(yǎng)瓶中的液體，用HanK氏液沖洗各組細(xì)胞，0.25％胰酶消化3min～5min，收集細(xì)胞至離心管中，1200r/min離心10min，提取 mRNA。

1.2.3 細(xì)胞mRNA的提取 mRNA的提取使用 Pharmacia公 司 的 QuickPrepRmicromRNA purification試劑盒，詳細(xì)步驟按操作說(shuō)明進(jìn)行，提取的總RNA于分光光度計(jì)（Backman 640）定量。

1.2.4 雙鏈cDNA的合成 采用CLONTECH公司PCR-Select TMcDNA SubtractionKit提供的試劑和酶，分別以上述 driver和 tester mRNA為模板，進(jìn)行單鏈及雙鏈cDNA的合成。

SSH方法利用的寡苷核酸：以下是應(yīng)用于SSH的寡核苷酸（均由 Clontech公司的PCR-select［TM］cDNA subtraction kit試劑盒提供）：ADAPTER-1：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3′，3′-GGC CGT CCA-5′；ADAPTER-2R：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGA GGT-3′，3′-CGGCTCCA-5′。

第1輪 PCR引物：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGCC-3′；第2輪 PCR引物：NESTEDPCR引物1：5′-TCG AGCGGCCGC CCG GGC AGGT-3′；NESTEDPCR 引物 2R：5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′。

1.2.5 SSH差減雜交 詳細(xì)操作過(guò)程按Clontech公司的 PCR-selectTMcDNA subtraction kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用glassmilk將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即差異cDNA片斷回收并克隆到pGEM-T easy載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL1-Blue菌，隨機(jī)篩選30個(gè)白色克隆，挑單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h～16h，取1ml菌液用于測(cè)序，余下菌液以20％甘油 －80℃保存。

1.2.6 測(cè)序 由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.7 GenBank序列比較 將測(cè)序結(jié)果通過(guò)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行序列比較，尋找該片段在基因組和dbEST中是否有明顯同源的序列。

1.3 結(jié)果

1.3.1 SSH結(jié)果 以病毒組心肌細(xì)胞cDNA為tester，以病毒感染同時(shí)有益氣活血中藥復(fù)方促進(jìn)的心肌細(xì)胞 cDNA為 driver，兩組 cDNA進(jìn)行雜交，得到的消減雜交文庫(kù)稀釋1000倍后，作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體中，進(jìn)行DNA序列分析。

表1顯示，通過(guò)序列測(cè)定結(jié)果，在ncbi的blastn結(jié)合 blastx分析，得到如下結(jié)果（部分）并列于下表。

表1 利用SSH技術(shù)研究益氣活血中藥復(fù)方促進(jìn)表達(dá)的基因

表2 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴(kuò)增Ct值

1.3.2 熒光定量rt-PCR驗(yàn)證結(jié)果 圖1、2和表2、3顯示，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因在中藥組中的表達(dá)均比病毒組中高，說(shuō)明該基因的表達(dá)可被益氣活血中藥復(fù)方上調(diào)。

圖1 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴(kuò)增曲線圖

表3 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴(kuò)增Ct值

圖2 Cytochrome c oxidase subunitⅡ基因rt-PCR擴(kuò)增曲線圖

4 討論

病毒性心肌炎屬中醫(yī)學(xué)“溫病”、“心悸”、“胸痹”、“心痹”、“怔忡”、“虛損”等范疇。本病發(fā)病因身體素虛復(fù)感外邪所致。病位涉及心、肺、脾、胃等臟腑，其中以心為主要病位。《素問(wèn)·靈蘭秘典論》曰：“心者，君主之官也，神明出焉”；《諸病源候論》云：“心藏神而主血脈，虛勞損傷血脈，致令心氣不足，因?yàn)樾爸?，則使驚而悸動(dòng)不安?！毙奈挥谛刂校餮}，氣為血帥、血為氣母，氣行則血行，若心氣虛、運(yùn)血無(wú)力，血脈運(yùn)行不暢則心血瘀阻。本病病機(jī)以正虛為本，血瘀為標(biāo)。有學(xué)者認(rèn)為，該病后期容易耗氣并致心脈瘀阻［4］，“毒、瘀、虛”三者膠結(jié)貫穿始終；早期心肌細(xì)胞變性壞死，心肌組織缺血、缺氧、心肌間質(zhì)水腫，大量的自由基堆積局部，心肌微循環(huán)障礙，此即為瘀血，故早期治療往往于方中加入活血化瘀之品［5］。益氣活血法用于病毒性心肌炎的臨床治療，已得到肯定療效［6］。益氣活血中藥復(fù)方以黃芪、白參為主藥，大補(bǔ)元?dú)?，固脫生津，安神。黃芪性微溫、味甘，歸肺脾經(jīng)，補(bǔ)脾胃而建立中氣，護(hù)衛(wèi)固表。藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃芪具有強(qiáng)心、利尿、降壓、保肝、提高免疫功能的作用，對(duì)感染病毒以及藥物中毒的心肌均有明顯的保護(hù)作用，黃芪總黃酮在病毒性心肌炎急性期可改善病毒性心肌炎引起的泵功能的損害［7～9］。白參性味甘平，歸脾、肺經(jīng)，大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，寧神益智。人參能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，也對(duì)動(dòng)物心肌無(wú)力等癥狀有改善作用［10］。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，色赤，味苦，微寒，歸心肝經(jīng)，能活血化瘀、通心脈、補(bǔ)養(yǎng)心血。有實(shí)驗(yàn)表明，丹參保護(hù)心肌，可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈的流量，有減輕心肌缺血損傷程度和加速恢復(fù)的作用［11］。郁金歸心、肝、肺經(jīng)，可行氣化瘀，清心安神為臣藥。麥冬性微寒味甘質(zhì)潤(rùn)，有滋陰潤(rùn)肺、益胃生津、清心除煩的功效，對(duì)心血管系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)均有良性作用［12］。白茅根味甘、性寒，入肺、胃、膀胱經(jīng)，清瀉濕熱、利尿，能除伏熱、導(dǎo)濕熱，從小便而出，以防余熱之邪戀結(jié)體內(nèi)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂其：“主治勞傷虛羸，補(bǔ)中益氣，除瘀血，血閉，寒熱，利小便。”二藥與黃芪、人參配伍，共奏益氣養(yǎng)陰之效，且甘寒之白茅根可導(dǎo)伏熱與濕熱下行，從小便而走；微寒之麥冬，可清解心肺客熱，恰合本病溫?zé)嶂耙缀臍鈧幍牟C(jī)特點(diǎn)。諸藥合用，使心氣得補(bǔ)，乃行血有力，血行絡(luò)通，而無(wú)留滯之患，共收益氣活血之效。本方兼以清熱養(yǎng)陰，與君臣藥配伍，達(dá)標(biāo)本同治目的，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“治病求本，兼顧其標(biāo)”的整體辨治理念。

心肌能量代謝障礙和心功能減退是病毒性心肌炎重要的病理生理特征。大量研究表明，VMC心功能減退與心肌細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)蛋白改變、離子泵功能障礙等多種因素有關(guān)［13］。VMC急性期病毒通過(guò)心肌細(xì)胞的相關(guān)受體侵入心肌細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、溶解細(xì)胞后得以擴(kuò)散。在病毒感染過(guò)程中，吸附穿入細(xì)胞及擴(kuò)散出細(xì)胞都會(huì)對(duì)細(xì)胞膜、線粒體膜造成直接損傷［14］，引起線粒體內(nèi)膜上 Ca2+-ATP酶的活性下降和線粒體鈣化。病毒血癥使氧自由基生成增加及引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化水平增強(qiáng)。線粒體的含量占心肌細(xì)胞容積的35％～40％，線粒體不僅承擔(dān)著心肌90％的能量供應(yīng)，且在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度、細(xì)胞凋亡的發(fā)生等方面起著重要作用［15］。細(xì)胞色素C氧化酶（復(fù)合物 IV）是線粒體內(nèi)膜的固有成分［16］，線粒體是進(jìn)行三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化的重要細(xì)胞器，其能量合成需要內(nèi)膜上呼吸鏈關(guān)鍵酶——細(xì)胞色素氧化酶的參與［17］。細(xì)胞色素 C為生物氧化過(guò)程中的電子傳遞體，其作用原理為在酶存在的情況下，對(duì)組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。細(xì)胞色素 C可以在呼吸鏈復(fù)合酶Ⅲ（細(xì)胞色素還原酶）和 IV（細(xì)胞色素氧化酶）之間傳遞電子［18］。氧化態(tài)的細(xì)胞色素C可直接清除O2－，還原態(tài)的細(xì)胞色素C可清除H2O2，且線粒體的氧自由基代謝狀態(tài)與細(xì)胞凋亡之間存在因果關(guān)系［19］。細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ通常被稱(chēng)為核心亞基［20］。細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因?qū)儆诰€粒體基因，其編碼的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ是呼吸鏈的重要組成部分［21］，且細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ是細(xì)胞色素C氧化酶的活性中心，其活性的改變導(dǎo)致線粒體呼吸鏈的電子傳遞受阻，并直接將電子泄漏于線粒體基質(zhì)內(nèi)，使超氧陰離子產(chǎn)生增多，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的氧應(yīng)激水平提高［22］。

抑制性消減雜交技術(shù)是一種有效的差異表達(dá)基因分離方法，其基本原理如下：首先將兩個(gè)群體的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中含有特異表達(dá)基因的樣本為 tester，另一組為 driver，tester和 driver cDNA雜交，去除雜交體 cDNA，未形成雜交體的 cDNA即是在tester中特異表達(dá)或高表達(dá)而driver中不表達(dá)或低表達(dá)的基因。抑制性消減雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)楸粩U(kuò)增和克隆的雙鏈 cDNA的每條鏈來(lái)源于第1次雜交的不同體系且又進(jìn)行了第2次雜交，所以具有很高的特異性［23］，尤其在篩選低豐度表達(dá)基因之間的差異方面更有優(yōu)越性。在本研究ssh結(jié)果中，中藥組與病毒組相比，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ基因表達(dá)增強(qiáng)，其可能的機(jī)制是益氣活血中藥復(fù)方使受感染心肌細(xì)胞的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ基因活性增加，從而提高線粒體的氧應(yīng)激水平，抑制CVB3感染后細(xì)胞凋亡的發(fā)生，達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞、治療病毒性心肌炎的目的，并將為病毒性心肌炎的防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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