健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛證及抗生素腸道＊菌群失調(diào)模型小鼠的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用

李秋明，張亞杰，張大方，劉 佳，李麗靜

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

健脾止瀉顆粒是以黃連、白術(shù)等6味藥為組方的健脾止瀉藥，臨床主治脾腎虛寒型泄瀉。為觀察其藥效作用，我們進(jìn)行了以苦寒瀉下中藥大黃造成小鼠脾虛模型，選用厭氧及需氧菌選擇性培養(yǎng)基測(cè)定糞便中代表性菌種含量，以鹽酸林可霉素造成腸道菌群失調(diào)模型，選用厭氧及需氧菌選擇性培養(yǎng)基測(cè)定糞便中代表性菌種含量等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察健脾止瀉顆粒對(duì)腸道菌群的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

昆明種小白鼠，雌雄各半，體重20g±2g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK-（吉）2008-0001。

1.2 藥物

健脾止瀉顆粒由課題制劑組提供，規(guī)格為0.5g/片，每克含生藥4g，批號(hào)20090311。使用時(shí)用生理鹽水制成混懸液滅菌后4℃保存?zhèn)溆?；大黃：蓼科植物唐古特大黃，水煎成1ml含1g生藥的水煎液，滅菌后4℃保存?zhèn)溆?；麗珠腸樂(lè)購(gòu)于吉林省吉深藥店，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)090321；硫酸慶大霉素注射液為天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，8萬(wàn)單位/支，0908271。

1.3 培養(yǎng)基

雙歧桿菌培養(yǎng)基（BS）、乳桿菌培養(yǎng)基（LBS）、伊紅美蘭平板（EMB）、葡萄球菌選擇培養(yǎng)基（SP）均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌培養(yǎng)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.4 菌株

大腸埃希菌（ATCC44102）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、痢疾桿菌（ATCC27336）、金黃色葡萄球菌（ATCC26003）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，為本室保藏。

1.5 儀器

全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，HZQ-F160）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9123A）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，YXQ-LS-18SL）；超凈工作臺(tái)；金屬單道移液器（丹麥Cappelen，CappAero）；分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204）；磁力加熱攪拌器（國(guó)華電器有限公司，78-1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠腸道菌的影響

2.1.1 分組及造模 將雌雄小白鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、造模組、陽(yáng)性對(duì)照組與健脾止瀉顆粒高、中、低治療組，每組6只，雌雄各半。除正常對(duì)照組外，其余各組依文獻(xiàn)［1］所述脾虛造模方法灌胃大黃煎汁造模7d，獲得脾虛證模型。然后各組分別以0.5、1、2mg/kg劑量灌胃健脾止瀉顆粒7d。造模組同期灌胃生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照藥給予麗珠腸樂(lè)。

2.1.2 標(biāo)本采集與培養(yǎng) 按摩小白鼠腹部促其排便，將糞便置于無(wú)菌紙上稱量后迅速轉(zhuǎn)移至滅菌研瓶?jī)?nèi)搗碎，然后用無(wú)菌生理鹽水做對(duì)數(shù)稀釋。取10倍連續(xù)稀釋液，用微量移液器取20μl滴于培養(yǎng)基表面，然后迅速置于厭養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。腸道需氧菌群檢測(cè)時(shí)糞便標(biāo)本依預(yù)試結(jié)果選取10－3、10－4、10－5、10－6稀釋度，接種后在需氧條件下37℃培養(yǎng)24h之后計(jì)數(shù)典型菌落。

進(jìn)行雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌的培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)。各種菌培養(yǎng)方法如下。雙歧桿菌：BBL瓊脂，37℃ 48h～72h厭氧培養(yǎng)；乳桿菌：LBS瓊脂，37℃ 48h培養(yǎng)；腸桿菌：EMB瓊脂，37℃24h～48h培養(yǎng)；腸球菌：Ec瓊脂，37℃ 24h～48h培養(yǎng)。

2.1.3 統(tǒng)計(jì)方法 每克標(biāo)本的菌落數(shù)=典型菌落數(shù)÷稀釋度 ×50。檢測(cè)值一般較大，為計(jì)算方便將其轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值，即lgCFU/g形式。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一般體征：造模鼠自第2天起開(kāi)始出現(xiàn)軟泥樣便，第5天出現(xiàn)腹瀉便溏、食欲不振、畏寒扎堆等脾虛癥狀。隨著造模的進(jìn)行上述癥狀逐漸加重。造模1周后自然恢復(fù)鼠的脾虛證狀基本保持不變。健脾止瀉顆粒治療組隨著治療的進(jìn)行，脾虛證狀明顯改善，至服藥完畢時(shí)一般體征恢復(fù)正常。

表1 健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

表1 健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較：###P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（g/kg）雙歧桿菌lgCFU/g乳桿菌lgCFU/g正 常 對(duì) 照 組10.335±0.129 10.274±0.065模 型 對(duì) 照 組 9.787±0.035### 9.962±0.076###麗 珠 腸 樂(lè) 組 10.929 ±0.074＊＊＊ 10.536 ±0.041＊＊＊健脾止瀉顆粒高劑量組 2 10.108±0.100＊＊＊ 10.207±0.076＊＊健脾止瀉顆粒中劑量組 1 10.014±0.440＊＊ 10.076±0.049*健脾止瀉顆粒低劑量組 0.5 9.978±0.208*9.997±0.063

表2 健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

表2 健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）腸桿菌lgCFU/g腸球菌lgCFU/g正 常 對(duì) 照 組7.075±0.029 6.528±0.033模 型 對(duì) 照 組 7.393±1.061### 6.555±0.023#麗 珠 腸 樂(lè) 組 7.378±0.046 6.532±0.022健脾止瀉顆粒高劑量組 2 7.165±0.034＊＊＊ 6.377±0.076＊＊健脾止瀉顆粒中劑量組 1 7.344±0.082* 6.508±0.051*健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 7.386±0.046 6.529±0.050

2.2 健脾止瀉顆粒對(duì)抗生素引起小鼠腸道菌失調(diào)的影響

2.2.1 分組及造模 將雌雄小白鼠隨機(jī)分成造模組與治療組，每組6只，雌雄各半。依文獻(xiàn)［1］所述抗生素引起小鼠腸道菌失調(diào)模型為每天灌胃鹽酸林可霉素0.2ml/只，造模5d，獲得抗生素引起小鼠腸道菌失調(diào)模型。然后按2、1、0.5g/kg劑量灌胃健脾止瀉顆粒7d。造模組同期灌胃生理鹽水，使其成為自然恢復(fù)對(duì)照組。

2.2.2 標(biāo)本采集與培養(yǎng)（同2.1.1）

2.2.3 統(tǒng)計(jì)方法（同2.1.3）

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一般體征：各組動(dòng)物外觀體征沒(méi)有明顯區(qū)別，飲食、毛板、活動(dòng)、體重增長(zhǎng)情況均無(wú)明顯差異。

表3 健脾止瀉顆粒對(duì)抗生素菌群失調(diào)模型小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

表3 健脾止瀉顆粒對(duì)抗生素菌群失調(diào)模型小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）雙歧桿菌lgCFU/g乳桿菌lgCFU/g正 常 對(duì) 照 組10.411±0.072 10.274±0.053模 型 對(duì) 照 組 9.484±0.116###△△ 9.654±0.049△△麗 珠 腸 樂(lè) 組 9.770±0.099＊＊ 10.175±0.114＊＊健脾止瀉顆粒高劑量組 2 9.604±0.037* 9.669±0.051健脾止瀉顆粒中劑量組 1 9.538±0.053 9.605±0.081健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 9.530±0.056 9.595±0.032

3 討論

泄瀉可能為外邪（主要是致病菌）入侵或體虛引起，而脾虛泄瀉主要由正氣虛而外邪入引起。已有學(xué)者運(yùn)用微生態(tài)學(xué)理論與方法去詮釋。中醫(yī)脾胃理論研究證實(shí)，大黃脾虛模型小鼠腸道菌群失調(diào)，健脾方藥具有一定的調(diào)整菌群失調(diào)作用［1、2］。健康人體或動(dòng)物胃腸道存在著龐大的菌庫(kù)，同脾胃系統(tǒng)乃至整個(gè)機(jī)體有著實(shí)質(zhì)性的相互依存性。腸道微生態(tài)體系在生理狀態(tài)下對(duì)人體具有藥物活化、免疫激活、生物拮抗、解毒與營(yíng)養(yǎng)等功能，而病理狀態(tài)下則成為內(nèi)源性感染或耐藥性的根源［3～6］。西醫(yī)各科與微生態(tài)學(xué)相結(jié)合的腸道菌群研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，中醫(yī)藥與微生態(tài)學(xué)的結(jié)合研究已有起步。為此，探討健脾止瀉藥健脾止瀉顆粒對(duì)苦寒瀉下藥物及腸道菌群影響的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用，為健脾止瀉顆粒的藥效機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于臨床可見(jiàn)部分患者長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素，導(dǎo)致腸內(nèi)菌群失調(diào)后長(zhǎng)期泄瀉，因此選擇林可霉素造成抗生素型菌群失調(diào)模型，以探討健脾止瀉顆粒是否具有一定的治療作用。

表4 健脾止瀉顆粒對(duì)抗生素菌群失調(diào)模型小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

表4 健脾止瀉顆粒對(duì)抗生素菌群失調(diào)模型小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）腸桿菌lgCFU/g腸球菌lgCFU/g正 常 對(duì) 照 組7.087±0.049 6.510±0.034模 型 對(duì) 照 組 6.464±1.036### 5.511±0.031麗 珠 腸 樂(lè) 組 6.449±0.061 5.514±0.036健脾止瀉顆粒高劑量組 2 6.414±0.088 5.512±0.018健脾止瀉顆粒中劑量組 1 6.423±0.055 5.515±0.027健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 6.418±0.061 5.510±0.048

選用大黃脾虛造模后發(fā)現(xiàn)，模型存在顯著的微生態(tài)失調(diào)，所檢測(cè)的2種腸道厭氧菌均有不同程度的下降。通過(guò)健脾止瀉顆粒對(duì)脾虛小鼠治療前后的厭氧菌群檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)本方對(duì)異常下降的2種厭氧菌均有較明顯的扶植作用。乳桿菌在治療后接近或達(dá)到正常水平，而雙歧桿菌則超過(guò)了造模前含量。由此可知，健脾止瀉顆粒能通過(guò)對(duì)異常低下的厭氧菌產(chǎn)生扶植作用，使之與需氧菌的比值達(dá)到正常范圍，從而恢復(fù)微生態(tài)平衡。厭氧菌減少是腸道菌群失調(diào)的基本改變之一。健脾止瀉顆粒對(duì)雙歧桿菌這一重要的“健康因子”表現(xiàn)出明顯的扶植作用。通過(guò)扶植益生菌而間接排斥病原菌或條件致病菌，達(dá)到扶正祛邪之功效，是微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的基本作用途徑之一。

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［2］陳海龍，裴德凱，王冬梅，等.多器官功能不全綜合征時(shí)腸道細(xì)菌微生態(tài)學(xué)改變的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，1999，11（1）：22-24.

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［6］陳小野.實(shí)用中醫(yī)脾虛證候模型學(xué)［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)合醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993.12-26.

△通訊作者：李麗靜。