桂春燕，陳義倫，*，謝曉平，董欣睿，宋 冀，吳玉雙，韓明渠，刁日明，周 波，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；3.北京匯通達(dá)科技有限公司，北京100086；4.天津牧光生物技術(shù)有限公司，天津300193）

黃河三角洲耐高滲堿性纖維素酶產(chǎn)生細(xì)菌YRD-19的誘變育種和產(chǎn)酶條件優(yōu)化

桂春燕1，陳義倫1，*，謝曉平2，董欣睿2，宋 冀2，吳玉雙3，韓明渠3，刁日明4，周 波2，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；3.北京匯通達(dá)科技有限公司，北京100086；4.天津牧光生物技術(shù)有限公司，天津300193）

用紫外線對(duì)1株產(chǎn)耐鹽堿纖維素酶的枯草芽孢桿菌YRD-19進(jìn)行誘變育種，獲得產(chǎn)酶能力是出發(fā)菌株5.97倍，并且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定的菌株YRD-19-35。進(jìn)一步對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究，優(yōu)化了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基為：1.5%乳糖，1.5%蛋白胨，NaCl∶KH2PO4=5∶1，添加量為0.55%；優(yōu)化培養(yǎng)條件為：接種量為2%，發(fā)酵溫度為37℃，培養(yǎng)基初始pH為8.0，種子活化時(shí)間為24h，發(fā)酵時(shí)間為48h，裝液量為50mL，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)菌株YRD-19-35產(chǎn)酶的酶活力達(dá)到最高。在上述條件下，纖維素酶活力可達(dá)182.705U/g。

紫外誘變，纖維素酶，酶活力，發(fā)酵條件

Abstract：The original strain Bacillus sp.YRD-19 was mutated by U∨，and its enzyme productivity was 5.97 fold higher than that of parent strain.The continuous 6 generations test showed that the mutant YRD-19-35 was stable in the alkaline cellulase（CMCase）production.The effects of compositions of culture medium and cultural conditions on cellulose production were investigated.The optimal culture media were：lactose 1.5%，peptone 1.5%，NaCl∶KH2PO4=5∶1（0.55%）.The optimum enzyme-producing conditions were pH 7.2 at 37℃，and the enzyme activity reached 182.705U/g after 48h of culture.

Key words：ultraviolet mutagenesis；cellulase；enzyme activity；fermentation conditions

堿性纖維素酶在堿性條件下具有內(nèi)切!-1，4葡聚酶活力，已經(jīng)成為一種世界各國普遍重視的新型酶制劑，堿性纖維素酶具有耐堿性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、pH適應(yīng)廣泛等特點(diǎn)［2］，已經(jīng)在洗滌劑工業(yè)成功地獲得應(yīng)用，在食品、化工、造紙、麻紡、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域均有重要作用和應(yīng)用前景［1］。但是長期以來，纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力都不太理想，因此通過誘變技術(shù)選育纖維素酶高產(chǎn)菌株就成了解決這個(gè)問題的關(guān)鍵［3］。本實(shí)驗(yàn)采用的菌種分離自黃河三角洲鹽堿地區(qū)的堿性土壤中，不僅能夠分泌堿性纖維素酶，而且分泌的纖維素酶能夠耐高鹽，可以應(yīng)用到比較特殊的環(huán)境中去。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌YRD-19為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，篩選出產(chǎn)酶較高、酶活穩(wěn)定的菌株YRD-19-35，并且對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種YRD-19 由本實(shí)驗(yàn)室從黃河三角洲的鹽堿地區(qū)分離到的一株耐鹽堿，并能分泌耐鹽堿纖維素酶的枯草芽孢桿菌；LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10.0g，酵母膏 5.0g，氯化鈉 10.0g，水 1000mL，pH7.0；選擇培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉10.0g，硫酸銨4.0g，磷酸二氫鉀2.0g，蛋白胨1.0g，七水硫酸鎂0.15g，制霉菌素 50萬單位，瓊脂 16～20g，水 1000mL，pH7.0～7.5；種子活化培養(yǎng)基［2］（30mL/瓶） 蛋白胨10.0g，酵母粉 10.0g，CMC-Na 10.0g，氯化鈉 5.0g，KH2PO41.0g，水 1000mL，pH7.2～7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基（50mL/瓶）

蛋白胨 10.0g，酵母粉 10.0g，CMC-Na 10.0g，氯化鈉 5.0g，KH2PO41.0g，秸 稈少 許（0.25g/瓶），水1000mL，pH7.2～7.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株YRD-19生長曲線的繪制 將菌株YRD-19在LB液體培養(yǎng)基中活化18h，接入250mL三角瓶中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)。并于接種后的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24h，取一定菌液進(jìn)行稀釋后，利用分光光度計(jì)在600nm的波長下測(cè)定吸光度值。然后以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制出菌株YRD-19的生長曲線。

1.2.2 菌株YRD-19的誘變處理

1.2.2.1 菌懸液的制備 取1環(huán)YRD-19菌種接種到液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期，然后離心沉淀菌體，棄去上清液［4］。用0.85%生理鹽水（已滅菌）將菌體制成懸浮液，再離心，洗滌菌體兩次。將菌懸液適當(dāng)稀釋，制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌液濃度約1 ×108個(gè)/mL，備用［5］。

1.2.2.2 紫外誘變處理［4］紫外燈照射前，先預(yù)熱20～30min。取8個(gè)培養(yǎng)皿，然后取5mL菌懸液置于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌器的攪拌下，選用20W紫外燈，照射距離為30cm，進(jìn)行不同時(shí)間的照射處理。

1.2.2.3 突變株篩選 平板初篩：取誘變后的菌液，適當(dāng)稀釋后在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，以未經(jīng)誘變的菌液稀釋涂平板對(duì)照，37℃培養(yǎng)48h后，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的轉(zhuǎn)接到LB斜面培養(yǎng)基上［6］。搖瓶復(fù)篩：將初篩到的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，37℃搖床培養(yǎng) 48h，測(cè)定酶活［7］。

1.2.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［8］為了確定誘變菌株YRD-19-35的最優(yōu)產(chǎn)酶條件，在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇不同的碳源、氮源以及營養(yǎng)鹽之比進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析來確定誘變菌株YRD-19-35的產(chǎn)酶最優(yōu)培養(yǎng)基配方；并且在產(chǎn)酶最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化（種齡、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH）。

1.2.4 酶活測(cè)定方法［9］發(fā)酵液在4℃條件下，經(jīng)5000r/min離心10min，取上清液作為粗酶液，并且用0.2mol/L的磷酸緩沖液（pH=8.0）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取2mL稀釋過的酶液加入到25mL刻度試管中，加入2mL1%的CMC-Na底物溶液，在60℃的水浴中保溫30min，再加入5mL DNS試劑，在沸水中煮沸5min，之后用冷水冷卻至室溫，定容至25mL。在540nm下測(cè)定吸光度值，以滅活的酶液作為空白對(duì)照。

在pH8.0，60℃條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1!g還原糖所用的酶量作為一個(gè)酶活力單位U/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株YRD-19生長曲線的測(cè)定

由圖1可以看出，YRD-19在一個(gè)較短的延遲期后，菌株即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)12h以后即進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度基本保持不變，因此對(duì)出發(fā)菌株宜選用培養(yǎng)10～11h（對(duì)數(shù)生長中后期）的菌體制成菌懸液，進(jìn)行誘變處理。

圖1 菌株YRD-19的生長曲線

2.2 紫外線誘變劑量的選擇

從圖2可以看出，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，在0～90s照射時(shí)間內(nèi)，菌落數(shù)下降較快，活菌數(shù)迅速減少。照射時(shí)間約為46、62s時(shí)，其致死率分別為80%、90%；100s 后，細(xì)菌幾乎全部死亡。Leslie A［10］等 和Gerard A［11］等研究表明，致死率為99.0%時(shí)，可保證菌體發(fā)生最大程度的突變，故在本實(shí)驗(yàn)中選擇在20W紫外燈，菌懸液距紫外燈管30cm下，照射64s為紫外誘變的劑量。

圖2 菌株YRD-19紫外線照射時(shí)間與細(xì)菌存活率的關(guān)系

2.3 菌株的誘變與篩選

2.3.1 致死率為90%的誘變菌株的初篩 通過紫外誘變，一共選出了6株誘變菌株。通過平板初篩，比較各菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值，并與出發(fā)菌株進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。

由表1可見，6株誘變菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值相差比較大，并且比出發(fā)菌株YRD-19的要大很多，說明它們的酶活力比出發(fā)菌株YRD-19要高，它們之間的酶活也有較大的差異。但是透明圈只能用來初步判定菌株的酶活高低，不能完全代表菌種的產(chǎn)酶能力，這還需要對(duì)菌種進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩。

表1 致死率為90%的初篩菌株與出發(fā)菌株的比較

2.3.2 致死率為90%的誘變菌株的復(fù)篩 通過搖瓶復(fù)篩，測(cè)得6株誘變菌株的酶活力，并與出發(fā)菌株YRD-19進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 致死率為90%的復(fù)篩菌株與出發(fā)菌株的酶活比較

從表2可以看出，誘變菌株與出發(fā)菌株相比酶活都有了很大的提高。其中，YRD-19-8、YRD-19-13和YRD-19-35的酶活力分別是出發(fā)菌株YRD-19 的5.52、5.54、5.97 倍，YRD-19-11、YRD-19-12和YRD-19-32的酶活力分別是出發(fā)菌株YRD-19的3.51、3.13、3.23 倍。

2.3.3 誘變菌株酶活穩(wěn)定性的測(cè)定 對(duì)6株誘變菌株分別進(jìn)行了5次傳代，并分別進(jìn)行了酶活測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可以看出，經(jīng)過5次傳代之后，菌株YRD-19-8、YRD-19-11、YRD-19-12 和 YRD-19-13的酶活力都下降了，沒有良好的穩(wěn)定性；菌株YRD-19-32和YRD-19-35的酶活力基本上保持不變，具有良好的穩(wěn)定性。菌株YRD-19-35的酶活要比YRD-19-32的高一倍，所以我們最終選用菌株YRD-19-35作為誘變菌株。

表3 6株誘變菌株的酶活穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.4 菌株YRD-19-35產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 碳源是微生物生長和誘導(dǎo)產(chǎn)酶的重要物質(zhì)。纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，因此選擇合適的碳源是誘導(dǎo)產(chǎn)酶的重要條件。本實(shí)驗(yàn)采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（%）為：蛋白胨1.0，酵母粉1.0，KH2PO40.1，NaCl 0.5，調(diào)節(jié) pH 至7.2，以1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、1%麩皮、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖和1%乳糖為碳源，進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，研究不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表4可以看出，添加不同的碳源對(duì)纖維素酶活力的影響很大。以乳糖為碳源時(shí)產(chǎn)酶最高，說明乳糖是其發(fā)酵的最佳碳源。

2.4.1.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 本實(shí)驗(yàn)采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（%）為：乳糖 1.0，KH2PO40.1，NaCl0.5，以 1%蛋白胨、1%酵母粉、1%牛肉膏、0.5%蛋白胨+0.5%酵母粉、1%蛋白胨+1%酵母粉、1%硫酸銨、1%磷酸氫二銨等作為不同氮源，調(diào)節(jié)pH為7.2，進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，研究氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表5可以看出，硫酸銨會(huì)使發(fā)酵液的pH改變過大，影響纖維素酶的產(chǎn)生；磷酸氫二銨對(duì)pH的變化有緩沖作用，促進(jìn)產(chǎn)酶效果較好；而當(dāng)以蛋白胨作為氮源時(shí)產(chǎn)酶最多，所以以1%蛋白胨作為菌株YRD-19-35發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳氮源。

2.4.1.3 營養(yǎng)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響 在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中主要有兩種營養(yǎng)鹽：氯化鈉和磷酸二氫鉀，這兩者的添加質(zhì)量之比對(duì)菌株的產(chǎn)酶效果也有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)主要研究了以下三個(gè)比值對(duì)菌株YRD-19-35產(chǎn)酶效果的影響。結(jié)果見表6。

表6 不同營養(yǎng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表6可以看出，當(dāng)氯化鈉和磷酸二氫鉀的比值為5∶1時(shí)，菌株YRD-19-35的產(chǎn)酶效果最佳。

2.4.1.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源以及營養(yǎng)鹽的比例3個(gè)因素，即乳糖、蛋白胨、NaCl∶KH2PO4=5∶1。各取 3 個(gè)水平，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用SAS程序進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表7。

表7 正交實(shí)驗(yàn)水平表

由表8的 R值分析可知，蛋白胨 ＞乳糖 ＞NaCl∶KH2PO4，對(duì)產(chǎn)纖維素酶活影響最大的因素是蛋白胨添加量，其次是乳糖的添加量，而NaCl∶KH2PO4的添加量影響最小。

表8 纖維素酶活正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由方差分析表9可以看出，乳糖和蛋白胨的添加量對(duì)纖維素酶活高低影響都顯著，NaCl∶KH2PO4的添加量對(duì)纖維素酶活高低影響不顯著。

表9 正交設(shè)計(jì)纖維素酶活方差分析表

由表10可知，乳糖水平1，3之間差異不顯著，與水平2差異顯著，選擇水平2；蛋白胨水平1，3之間差異不顯著，與水平2差異顯著，選擇水平2；NaCl∶KH2PO4水平2，3之間差異不顯著，與水平1差異顯著，選擇水平1。即纖維素酶活最好的實(shí)驗(yàn)組合為A2B2C1，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件是：乳糖1.5%，蛋白胨1.5%，NaCl∶KH2PO40.55% 。

2.4.2 最適培養(yǎng)基下培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.2.1 種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將菌齡分別為24、36、48h的種子液接入搖瓶進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表11所示。

表10 多重比較結(jié)果

表11 種子活化時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表11表明，當(dāng)種子活化24h時(shí)再進(jìn)行發(fā)酵，纖維素酶的酶活力最高。

2.4.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選定不同發(fā)酵時(shí)間16、24、36、48、60h 進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖3的結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，菌株YRD-19-35產(chǎn)纖維素酶的效果最佳。

2.4.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 將培養(yǎng)24h的種子活化液以2%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同溫度（25、30、35、37、40、45℃）下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，研究培養(yǎng)溫度對(duì)菌株YRD-19-35產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4的結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，菌株YRD-19-35產(chǎn)纖維素酶的效果最佳。

2.4.2.4 培養(yǎng)基的初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將菌株 YRD-19-35 在不同初始 pH（6.0、7.2、8.0、9.0、10.0、12.0）的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件下進(jìn)行發(fā)酵，研究菌株的產(chǎn)酶情況，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為8.0時(shí)，

菌株YRD-19-35所產(chǎn)纖維素酶的酶活力最高。

圖5 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌YRD-19經(jīng)過紫外誘變，選育到一株纖維素酶活力提高5.97倍的誘變菌株YRD-19-35，在最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件下，纖維素酶活力最高可達(dá)到182.705U/g，比出發(fā)菌株27.213 U/g提高了6.71倍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：菌株YRD-19-35適合產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基條件為：1.5%乳糖，1.5%蛋白胨，NaCl∶KH2PO4=5∶1，添加量為 0.55% 。在此最適培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，研究溫度、pH、種子活化時(shí)間及發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為37℃，pH為8.0，種子活化時(shí)間為24h，發(fā)酵時(shí)間為48h，時(shí)菌株YRD-19-35產(chǎn)酶的酶活力達(dá)到最高。

通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，誘變菌株YRD-19-35誘導(dǎo)產(chǎn)酶的最佳碳源是乳糖。而之前發(fā)表過的文章多采用的是蔗糖［2］，羧甲基纖維素鈉［13］以及麩皮［8，12］等等，用乳糖作為纖維素酶的誘導(dǎo)劑還沒有研究。并且與以上這三種碳源相比較，使用乳糖作為該菌株的誘導(dǎo)劑，酶活分別提高了7.52%、33.30%和13.75%。

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Study on the screening and fermentation of osmophilic of alkaline cellulase higher production strain Baci//us sp.YRD-19

GUI Chun-yan1，CHEN Yi-lun1，*，XIE Xiao-ping2，DONG Xin-rui2，SONG Ji2，WU Yu-shuang3，HAN Ming-qu3，DIAO Ri-ming4，ZHOU Bo2，*
（1.Institute of Food Science and Engineering，Shandong Agriculture University，Tai’an 271018，China；2.Institute of Life Sciences，Shandong Agriculture University，Tai’an 271018，China；3.Beijing Huitongda Technology Company，Beijing 100086，China；4.Tianjin Muguang Bio-Technology Company，Tianjin 300193，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0163-05

2009-09-25 *通訊聯(lián)系人

桂春燕（1984-），女，在讀碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物。

國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)微生物菌種資源整理整合項(xiàng)目（2005DKA21201-13）；國家科技支撐計(jì)劃黃淮平原區(qū)農(nóng)田秸稈資源綜合利用技術(shù)集成研究與示范（2007BAD89B09-16）資助。