王艷珍，黃文燦，趙明智，劉明石，張瑤，楊東生,3,*

（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海519041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取蒼耳子油工藝

王艷珍1，黃文燦2，趙明智1，劉明石1，張瑤1，楊東生1,3,*

（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海519041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取蒼耳子中蒼耳子油的提取工藝。優(yōu)選溶劑后，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取過(guò)程中的提取時(shí)間、液料比和超聲波功率為隨機(jī)因子，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析（RSM）3個(gè)因素對(duì)蒼耳子油提取率的影響。結(jié)果表明，超聲波法提取蒼耳子油的最優(yōu)條件為:提取溶劑為乙醇,提取時(shí)間為26.3 min、液料比10.02∶1（mL∶g）、超聲波功率309.1 W，模型預(yù)測(cè)蒼耳子油提取率理論值可達(dá)到9.246%,在最優(yōu)的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，蒼耳子油的平均得率為9.250%,與理論值的相對(duì)誤差為0.04%。

蒼耳子;蒼耳子油;超聲波提取法;響應(yīng)面優(yōu)化法

Abstract：Response surface analysis methodology（RSM）was applied to optimize the ultrasonic-assisted extraction conditions of xanthium oil from Xanthium sibiricum Patr..After the optimum solvent ethanol was obtained,the single-factor experiments and Box-behnken central component experiments design were applied.The concentrations of ethanol in solvent,extraction time,ratio of liquid to solid and ultrasonic power were chosen as casual factors.RSM was employed to study on the effect of these factors on the yield of xanthium oil from Xanthium sibiricum Patr..The results show that the optimum solvent was ethanol,extracting time 26.3 min,ratio of liquid to solid 10.02∶1,ultrasonic power 309.1 W.Validation experiments were carried out at these optimum conditions,the average yield of general Xanthium oil is 9.250%.

Key words:Xanthium sibiricum Patr.;Xanthium oil;ultrasonic extraction;response surface methodology（RSM）

蒼耳子為菊科（Compositae）蒼耳屬植物（Xanthium L.）成熟干燥后帶總苞的果實(shí)[1]。全世界約有25種，分布于美洲、歐洲、亞洲和非洲北部，我國(guó)現(xiàn)有蒼耳品種6個(gè)，其中西伯利亞蒼耳分布最為廣泛[2]。蒼耳子作為一種重要的藥食同源藥材，有很強(qiáng)的藥用和食用價(jià)值。具有祛風(fēng)散熱、解毒殺蟲(chóng)之功效，中醫(yī)常用于治療頭暈、目赤、瘋癲、皮膚瘙癢等[3]。蒼耳子油在蒼耳子中含量約占40%，是主要的活性成分之一[4]。我國(guó)早在宋代就有蒼耳子油的藥用和食用記載，蒼耳子油中約78%的成分是亞油酸，同時(shí)亞油酸在制藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的開(kāi)發(fā)價(jià)值。然而目前對(duì)蒼耳子的研究以化學(xué)成分的解析、藥理藥效和臨床居多[5-7]，對(duì)蒼耳子有效成分提取工藝的探索較少，有限的研究主要集中在單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法上，少有對(duì)蒼耳子油提取過(guò)程中提取因子和提取率之間和提取因子之間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究，為提高蒼耳子油的提取率，對(duì)蒼耳子油提取過(guò)程中涉及的影響因子進(jìn)行全面合理的研究分析是非常重要。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）系采用多元二次回歸函數(shù)作為模型擬合的工具，將多因子試驗(yàn)中因子與指標(biāo)的相互關(guān)系用二次多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。集統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)建模和計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體，用于工藝條件優(yōu)化的有效方法。以較少試驗(yàn)次數(shù)和較短時(shí)間對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究，在生物化工過(guò)程優(yōu)化中有著廣泛應(yīng)用[8-10]。

以我國(guó)分布廣泛的西伯利亞蒼耳的蒼耳子油的提取過(guò)程為研究對(duì)象，對(duì)超聲波輔助蒼耳子油的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)超聲時(shí)間、超聲功率和提取的液料比工藝進(jìn)行全面的研究，為蒼耳子油的生產(chǎn)率的提高及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

西伯利亞蒼耳購(gòu)于藥房。

1.1.2 主要試劑

丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷，國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司;KS-600超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波科生儀器廠；MPA200萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯；恒溫水浴鍋：江蘇金壇醫(yī)療器械廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

蒼耳子用萬(wàn)能粉碎機(jī)間隔粉碎，過(guò)40目篩，制成粉末樣品待用。

1.2.2 蒼耳子油的超聲提取工藝

精密稱取一定量的蒼耳子粉末樣品，放入錐形瓶中，加入適量的溶劑進(jìn)行超聲間隔提取[11]，提取液轉(zhuǎn)入蒸餾裝置，將溶劑蒸發(fā)完全，精密稱取餾分為蒼耳子油的質(zhì)量。

1.2.3 蒼耳子油提取率的計(jì)算

1.2.4 提取溶劑的選擇

稱取10.000 g的蒼耳子粉末，分別采用100 mL丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷作為提取溶劑，300 W功率超聲間隔提取20 min，考察提取溶劑對(duì)蒼耳子油提取率的影響。

1.2.5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取10.000 g的蒼耳子粉末，以1.2.4所選擇的最優(yōu)溶劑，分別考察不同提取時(shí)間對(duì)蒼耳子油提取率的影響。

1.2.6 提取液料比對(duì)提取率的影響

采用以1.2.4所優(yōu)選的溶劑，1.2.5所選的最優(yōu)時(shí)間，分別考察不同液料比對(duì)蒼耳子油提取率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化蒼耳子油提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken[11]中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蒼耳子油提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析[12],試驗(yàn)因素及水平安排見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑對(duì)蒼耳子油提取率的影響

不同提取溶劑丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷作為提取溶劑對(duì)蒼耳子中蒼耳子油提取率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，同等條件下采用乙醇作為溶劑，蒼耳子油的提取率最高，三氯甲烷效果最差。溶劑的極性對(duì)超聲波提取是關(guān)鍵的因素之一，合適的溶劑極性不僅能夠使細(xì)胞在超聲情況下容易破碎，還可以使提取的有效成分能夠更好的溶解在溶劑中。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

采用乙醇為溶劑，液料比為 10∶1（mL∶g），分別考察超聲提取時(shí)間為 10、15、20、25、30 和 40 min 時(shí)蒼耳子油的提取率，結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出，提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，提取時(shí)間到達(dá)25 min后，蒼耳子油提取率已趨于穩(wěn)定，從時(shí)間和能源方面考慮，選取提取時(shí)間為25 min。

2.3 液料比對(duì)蒼耳子油提取率的影響

采用乙醇為溶劑，提取時(shí)間為25 min，分別考察液料比為 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL∶g）時(shí)對(duì)蒼耳子油提取率的影響,結(jié)果如圖3。

由圖3可以看出，開(kāi)始時(shí)蒼耳子油提取率隨著液料比的增加而增加,而當(dāng)液料比達(dá)到 10∶1（mL∶g）時(shí)，蒼耳子油提取率達(dá)到最高,而液料比大于10∶1時(shí),提取率變化不明顯,所以最佳的提取液料比在10∶1左右。

2.4 超聲功率對(duì)提取率的影響

采用乙醇為溶劑,提取時(shí)間為25 min，液料比為10∶1（mL∶g），考察超聲波功率分別為 200、250、300、350、400、450、500 W對(duì)蒼耳子油提取率的影響,結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出,開(kāi)始時(shí)蒼耳子油提取率隨提取的超聲功率的升高而增大，350 W時(shí)達(dá)到最大,而功率超過(guò)350 W后,提取率隨著超聲功率的增加反而下降。適當(dāng)?shù)某暡üβ誓軌驅(qū)?xì)胞有很好的破碎和提取作用，超聲波的功率過(guò)大時(shí)，對(duì)提取物而言可能是一種損害，加速了提取物在溶劑中的降解和揮發(fā)，破壞了提取物的成分。所以超聲波提取蒼耳子油的最佳功率在350 W左右。

2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蒼耳子油超聲提取的條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表 2，以 X1=（Z1－25）/10,X2=（Z2－10）/2.5,X3=（Z3－350）/50為自變量,以蒼耳子油提取率Y為響應(yīng)值,采用SAS RSREG程序進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experiment design and results of RSM

如表2所示,Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)了15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，1~12點(diǎn)為析因試驗(yàn)點(diǎn)，13~15為中心試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。同時(shí)通過(guò)擬合得到響應(yīng)面的二次方程為：Y=8.59466+0.278214X1+0.092739X2-1.549271X3-0.820094 X1X1+0.381863 X1X2+0.087283 X1X3-0.972841X2X2+0.152744X2X3-0.940109X3X3。

SAS RSREG回歸分析對(duì)方程和方程的各個(gè)因子進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方程ANOVA分析的結(jié)果Table 3 The results of ANOVA

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性用F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率 P（F＞Fα）值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P（F＞Fα）<0.01 時(shí)影響為高度顯著，P（F＞Fα）<0.05 影響顯著。由表3的分析結(jié)果可以看出：模型回歸P為0.000561，說(shuō)明模型回歸高度顯著，X3（超聲功率）、X12（超聲時(shí)間）、X22（液料比）和X32（超聲功率）的平方項(xiàng)對(duì)蒼耳子油的提取率影響高度顯著；X1（超聲時(shí)間）對(duì)蒼耳子油的提取率影響顯著；模型總體分析為一次項(xiàng)和二次項(xiàng)影響顯著，交互作用不太明顯，在3對(duì)交互作用的分析中，X1（超聲時(shí)間）和X2（液料比）的交互作用相對(duì)較強(qiáng)，其它的都不顯著。模型的回歸系數(shù)R2為98.42%，說(shuō)明模型響應(yīng)值（蒼耳子油提取率）的變化98.42%來(lái)自所選因變量，即超聲時(shí)間、液料比和超聲功率。響應(yīng)面的回歸方程代表了試驗(yàn)點(diǎn)中的98.42%。因此，回歸方程可以較好地描述與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，利用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算是合理可行的。

圖5～圖7是通過(guò)多元回歸方程使用MatlabR 2008a所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，所擬合的響應(yīng)曲面和等高線圖能比較直觀的反應(yīng)各因素和各因素間的交互作用和因素與響應(yīng)值Y之間的作用，圖5～圖7表明，3個(gè)響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸形曲面，同時(shí)等高線最小橢圓的中心在所選的-1～1范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)值（蒼耳子油提取率）在3個(gè)因子設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。3個(gè)圖中的等高線中圖5中等高線為橢圓形狀，同時(shí)低編碼值的X1和高編碼值的X1時(shí)，響應(yīng)值Y隨著X2的變化，變化趨勢(shì)不同。說(shuō)明X1（提取超聲時(shí)間）和X2（液料比）有一定的交互作用，這與方差分析的結(jié)果相吻合。分析圖6和圖7，這種交互的關(guān)系不明顯，說(shuō)明X2和X3，X1和X3間交互效應(yīng)不顯著，比較幾個(gè)圖可以看出X3（超聲功率）對(duì)響應(yīng)值蒼耳子油提取率）的影響比較大，表現(xiàn)為響應(yīng)值的變化比較大。

SAS軟件對(duì)模型極性分析給出了模型預(yù)測(cè)的響應(yīng)值最大提取率為：9.246%，同時(shí)取得此最大值的相關(guān)因子取值為：X1=0.128143、X2=0.008649 和 X3=-0.81733，根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得Z1＝26.28、Z2＝10.022和Z3＝309.13。因此，考慮到試驗(yàn)和工業(yè)生產(chǎn)的可行性，模型推算的超聲波法提取蒼耳子油的最佳工藝為：以乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為26.3 min，液料比為 10.02∶1（mL∶g）和超聲功率為 309.1 W。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下對(duì)蒼耳子油進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，蒼耳子油平均提取率為9.250%,與理論值相對(duì)誤差為0.04%,驗(yàn)證值與回歸方程所預(yù)測(cè)值相吻合得很好，驗(yàn)證了此模型的可行性。

3 結(jié)論

1）本文對(duì)蒼耳子油的超聲提取工藝做了較為全面的研究，首先進(jìn)行了溶劑的篩選，得到了適合蒼耳子油提取的最佳溶劑為乙醇。優(yōu)選溶劑后，以超聲時(shí)間，液料比和超聲功率為影響因子，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken中心組合方法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蒼耳子油提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步模型的優(yōu)化。模型的分析結(jié)果表明：擬合模型的相關(guān)系數(shù)R2為98.42%，說(shuō)明模型很好的擬合了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。超聲功率、超聲時(shí)間、液料比和超聲功率的平方項(xiàng)對(duì)蒼耳子油的提取率影響高度顯著；超聲時(shí)間對(duì)蒼耳子油的提取率影響顯著，模型總體分析為一次項(xiàng)和二次項(xiàng)影響顯著，表明這3個(gè)因子對(duì)蒼耳子油提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2）模型回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明，此方法合理可行。得到蒼耳子油提取的最佳工藝為：以乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為26.3 min，液料比為10.02∶1（mL∶g）和超聲功率為 309.1 W。模型預(yù)測(cè)蒼耳子油提取率理論值可達(dá)到9.246%，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均提取率為9.250%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.04%。對(duì)工業(yè)大批量提取蒼耳子油具有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Xanthium Oil from Xanthium Sibiricum Patr.Using Response Surface Method

WANG Yan-zhen1,HUANG Wen-can2,ZHAO Ming-zhi1,LIU Ming-shi1,ZHANG Yao1,YANG Dong-sheng1,3,*
（1.Zhuhai College Jilin University，Zhuhai 519041，Guangdong,China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，Jilin,China；3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，Jilin,China）

2010-01-27

王艷珍(1982—),女（漢），助教，碩士，主要從事生物技術(shù)

制藥的研究。

*通訊作者：楊東生(1980—),男（漢）,助理工程師，主要從事生物技

術(shù)制藥的研究。