王 群,桑 敏,李愛芬,張成武

暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣州 510632

雨生紅球藻培養(yǎng)過程中色素動(dòng)態(tài)變化與光合生理特性研究

王 群,桑 敏,李愛芬＊,張成武

暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣州 510632

以雨生紅球藻Haem atococcus pluvialisCG-06為實(shí)驗(yàn)材料,分析測定在正常培養(yǎng)周期內(nèi)藻細(xì)胞主要色素的變化動(dòng)態(tài)、光合生理特性,以及培養(yǎng)基中硝態(tài)氮的含量。結(jié)果表明,雨生紅球藻在綠色細(xì)胞階段的主要色素包括:葉綠素、葉黃素、β-胡蘿卜素,培養(yǎng)至紅色細(xì)胞階段增加了角黃素、海膽酮、蝦青素單酯及雙酯等次生類胡蘿卜素。硝態(tài)氮濃度在培養(yǎng)初期下降迅速,第 3 d降至 4.875 mg/L,下降了 85.3%,至第 7 d下降為 0.169 mg/ L。雨生紅球藻培養(yǎng)至第 7 d時(shí),細(xì)胞中開始檢測出蝦青素,含量為 0.159 mg/g,此時(shí)蝦青素合成速度較快,至第11 d蝦青素含量上升為 1.68 mg/g,在蝦青素合成初期β-胡蘿卜素的含量下降。藻細(xì)胞的光合速率、呼吸速率和NPQ在培養(yǎng)前期比較穩(wěn)定,第 7 d細(xì)胞光合速率開始下降,而呼吸速率和NPQ則上升,在整個(gè)培養(yǎng)周期中,藻細(xì)胞的 Fv/Fm變化不明顯。

雨生紅球藻;蝦青素;類胡蘿卜素;氮素;光合特性

蝦青素,一種次生類胡蘿卜素,具有很強(qiáng)的著色及抗氧化作用,可廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品及養(yǎng)殖業(yè)[1],是一種具有高附加值和開發(fā)潛力的生物活性物質(zhì)。單細(xì)胞淡水綠藻雨生紅球藻 (Haem atococcus pluvialis)在生活史中的紅色細(xì)胞階段能大量積累蝦青素,研究報(bào)道蝦青素含量可達(dá)藻體干重的 2%～5%[2],是理想的天然蝦青素來源。

目前,利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素普遍采用兩步培養(yǎng)法,即首先在適宜條件下高密度培養(yǎng)雨生紅球藻以獲得最大生物量,然后通過改變培養(yǎng)條件誘導(dǎo)細(xì)胞積累蝦青素。因此,關(guān)于雨生紅球藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化[3-5]和蝦青素積累的誘導(dǎo)條件[6,7]等方面做了大量工作。研究證實(shí)高光強(qiáng)、高鹽和缺氮等脅迫條件有利于雨生紅球藻積累蝦青素,其中氮素對(duì)雨生紅球藻的生長和蝦青素積累有著顯著影響。Lee等的研究表明,雨生紅球藻蝦青素的積累發(fā)生在細(xì)胞快速分裂和生長期[8],殷明焱和劉建國研究報(bào)道,當(dāng)培養(yǎng)基中氮濃度降低至 50μmol以下雨生紅球藻細(xì)胞開始積累蝦青素[9]。微藻培養(yǎng)體系中氮素的消耗是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程,隨著藻細(xì)胞密度的不斷提高,培養(yǎng)基中的氮素濃度將隨之下降。因此,本文以雨生紅球藻 CG-06藻株為研究對(duì)象,分析在正常培養(yǎng)條件下雨生紅球藻色素組成與含量的變化規(guī)律,探討其色素組成變化與氮素濃度以及藻細(xì)胞生理活性之間的關(guān)系,初步確定培養(yǎng)液氮素缺乏誘導(dǎo)蝦青素的適宜脅迫閾值等。這對(duì)于進(jìn)一步闡明雨生紅球藻蝦青素積累機(jī)制具有一定的理論價(jià)值,同時(shí)為利用雨生紅球藻高效生產(chǎn)蝦青素技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

雨生紅球藻Haem atococcus pluvialisCG-06,由暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種室提供。

1.2 培養(yǎng)條件

選用BBM培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為 23±1℃,整個(gè)培養(yǎng)周期的光照強(qiáng)度為 80 mol photo·m-2·s-1,采用 6 cm管徑的柱狀反應(yīng)器,24 h通氣 (VCO2:V空氣= 0.5∶95.5)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮的測定

采用全自動(dòng)連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀 (Bran-Luebbe AutoAnalyzer3,德國)測定硝態(tài)氮濃度。

1.3.2 生物量的測定

定期取一定體積藻液抽濾,于 80℃烘至恒重,冷卻后稱量獲得干重。

1.3.3 色素的提取

取 1 mL藻液,3500轉(zhuǎn)離心 5 min,將離心得到的藻泥用二甲基亞砜反復(fù)震蕩萃取至藻渣無色,用丙酮定容至 10 mL,萃取好的樣品經(jīng) 0.22μm濾膜過濾后用于 HPLC分析。

1.3.4 色素的分析與測定

采用Agilent100檢測系統(tǒng),DAD檢測器,Kromasil C18柱 (250×4.6 mm),柱溫 25℃,洗脫條件同文獻(xiàn)[10],流速為 1 mL/min,狹縫為 1 nm。三種標(biāo)樣的檢測波長分別為 663 nm(葉綠素 a)、476 nm(蝦青素)、450 nm(β-胡蘿卜素)。葉綠素a、β-胡蘿卜素、蝦青素根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時(shí)間確定,其它類胡蘿卜素的定性參考文獻(xiàn)[10],根據(jù)出峰時(shí)間進(jìn)行比對(duì)。葉綠素a、β-胡蘿卜素、蝦青素用外標(biāo)法進(jìn)行定量,其它類胡蘿卜素的定量根據(jù)峰面積比進(jìn)行換算。

1.3.5 呼吸速率和光合速率的測定

用 Clark氧電極 (Hansatech Oxygraph,英國)測定。反應(yīng)體系的溫度由超級(jí)恒溫水浴 (Grant,英國)控制。光合速率和呼吸速率用μmo lO2mg Chl-1h-1來表示,直接讀取溶解氧的變化值 (mg/L),計(jì)算藻的放氧速率。公式如下:

式中:P代表凈光合放氧速率;ΔO代表單位時(shí)間內(nèi)氧濃度變化值;chl a代表葉綠素 a的濃度;t為每兩次溶解氧濃度讀數(shù)間的間隔時(shí)間。

1.3.6 活體葉綠素?zé)晒獾臏y定

采用 XE-PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x(Walz,德國)測定,測量前將藻液暗適應(yīng) 20 min,葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fv/Fm和NPQ可通過葉綠素?zé)晒鈨x直接讀出。

2 結(jié)果分析

2.1 培養(yǎng)液氮素含量的變化與雨生紅球藻的培養(yǎng)特征

在正常條件下隨著培養(yǎng)時(shí)間的不斷延長,培養(yǎng)基中硝態(tài)氮濃度的變化如圖 1所示。由圖中看出,硝態(tài)氮的含量隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸降低,其中在培養(yǎng)初期下降迅速,至第 3 d已降至 4.875 mg/L,比原初培養(yǎng)基降低了 85.3%,從第 3 d至 11 d,氮濃度下降平緩,培養(yǎng)基在第 11 d的硝態(tài)氮含量降為 0.0214 mg/L,僅占原初培養(yǎng)基的 0.06%。細(xì)胞干重隨著硝態(tài)氮含量的下降而不斷上升,在培養(yǎng)初期藻細(xì)胞干重增長迅速,隨著氮濃度的下降,細(xì)胞干重增長變緩,培養(yǎng)的第 11 d,細(xì)胞干重又出現(xiàn)增長,可能是與藻細(xì)胞體積增大有關(guān)。隨著培養(yǎng)液氮素的不斷消耗,雨生紅球藻的培養(yǎng)特征亦隨之變化。前 5 d的藻液顏色為綠色,此時(shí)的藻細(xì)胞為綠色游動(dòng)細(xì)胞。此后藻液逐漸變?yōu)辄S褐色,鏡檢觀察大多數(shù)細(xì)胞仍為游動(dòng)細(xì)胞,但細(xì)胞中央有紅色色素積累,并隨著紅色色素面積的增大,藻液逐漸變?yōu)樯詈稚?。?11 d左右藻液變?yōu)樽丶t色,細(xì)胞進(jìn)入紅色孢子階段,最終藻液變?yōu)榧t色。

圖 1 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮濃度及H.pluvialisCG-06細(xì)胞干重的變化Fig.1 The change of nitrate nitrogen concentration in culture and the dryweight ofH.pluvialisCG-06

2.2 雨生紅球藻培養(yǎng)周期內(nèi)的主要色素組成

圖 2是雨生紅球藻紅綠兩種細(xì)胞階段的主要色素組成。根據(jù) HPLC圖譜,分析雨生紅球藻綠色細(xì)胞的主要色素組成有:葉綠素、葉黃素、β-胡蘿卜素(圖 2a,培養(yǎng)的第 3 d),與綠色細(xì)胞相比,紅色細(xì)胞(圖 2b,培養(yǎng)的第 19 d)還增加了角黃素、海膽酮、蝦青素單酯及雙酯等類胡蘿卜素。表 1是兩種細(xì)胞內(nèi)的色素與峰號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系(檢測波長為 476 nm)。

圖 2 雨生紅球藻 CG-06(a為綠色細(xì)胞,b為紅色細(xì)胞)色素提取液的 HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Pigment Extract fromH.pluvialis.CG-06(a:Green Cell,b:Red Cell)

表 1 雨生紅球藻色素與峰號(hào)對(duì)應(yīng)關(guān)系Table 1 The relationship between the pigment ofH.pluvialisCG-06 and the peak number

2.3 雨生紅球藻主要色素的動(dòng)態(tài)變化

圖 3反應(yīng)的是雨生紅球藻細(xì)胞葉綠素 a含量的變化動(dòng)態(tài)?？梢钥闯鲈谂囵B(yǎng)的前 9 d,葉綠素含量逐漸上升,第 9 d最高為 10.95 mg/g,此時(shí)培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量為 0.0335 mg/g。此后葉綠素含量開始下降,第 21 d的含量比初始值下降了 21.2%。

類胡蘿卜素的變化趨勢如圖 4所示。β-胡蘿卜素和葉黃素的周期變化相似,培養(yǎng)初期它們的含量逐漸上升,第 7 d達(dá)到最大,分別為 0.533 mg/g和1.191 mg/g。此時(shí)培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量下為0.169 mg/g。從圖 4可以看出,藻細(xì)胞培養(yǎng)至第 7 d時(shí)開始積累次生類胡蘿卜素,主要有海膽酮、角黃素和蝦青素。蝦青素和海膽酮的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長一直升高,第 21 d的含量分別為 1.033 mg/g和 2.547 mg/g。其中蝦青素的合成在前 4 d增長迅速,第 11 d時(shí)已達(dá)到 1.68 mg/g。角黃素含量一直比較穩(wěn)定,且含量遠(yuǎn)小于海膽酮和蝦青素。

圖 3 雨生紅球藻 CG-06葉綠素 a含量的變化Fig.3 The change of content for Chla ofH.pluvialisCG-06

圖 4 雨生紅球藻CG-06類胡蘿卜素含量的變化Fig.4 The change of content for Carotenoid ofH.pluvialisCG-06

2.4 雨生紅球藻培養(yǎng)周期內(nèi)的生理特性

圖 5是雨生紅球藻在培養(yǎng)周期內(nèi)光合與呼吸速率的變化?？梢钥闯?藻的光合作用水平在前 11 d比較穩(wěn)定,第 9 d的光合速率最高,為 42.63μmol O2(mg Chla)-1h-1,隨后光合速率逐漸下降,到第 21 d為 25.14μmol O2(mg Chla)-1h-1,下降了 41.1%。藻細(xì)胞的呼吸速率在培養(yǎng)的前 5 d變化不明顯,第 5 d為 10.19μmolO2(mg Chla)-1h-1,隨后細(xì)胞呼吸加強(qiáng),第 21 d的呼吸速率為 21.09μmol O2(mg Chla)-1h-1,是第 5 d的 2.1倍。Fv/Fm是 PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量,反映 PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率,從圖 6中可以看出,整個(gè)培養(yǎng)周期中藻細(xì)胞活體Fv/Fm比較穩(wěn)定,一直持續(xù)在 0.7左右。NPQ反映的是 PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的部分,NPQ值在前 7 d變化不大,到 9 d時(shí)開始上升,13 d以后增長速度變緩 (圖 6)。

3 討論

氮是藻類等植物生長所必須的大量元素,對(duì)其生長和發(fā)育有著重要的作用。隨著藻細(xì)胞密度的提高,培養(yǎng)基中的氮濃度消耗加大,最終將導(dǎo)致氮素營養(yǎng)的缺乏。本實(shí)驗(yàn)測得培養(yǎng)至第 11 d時(shí)培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮已基本檢測不出。

藻類細(xì)胞的色素組成及其動(dòng)態(tài)變化與培養(yǎng)基的氮素含量有一定關(guān)系(表 2)。氮是組成葉綠素的基本元素,同時(shí)氮含量不足會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成,從而導(dǎo)致葉綠素含量下降。Boussiba等研究報(bào)道,氮源缺乏引起雨生紅球藻細(xì)胞葉綠素含量下降[11]。從本實(shí)驗(yàn)分析得到的數(shù)據(jù)可以看出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,培養(yǎng)基中的氮素急劇下降,到第 9 d時(shí)培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量只有 0.0335 mg/L,從此葉綠素含量開始下降。這一結(jié)果與 Young等對(duì)杜氏鹽藻的報(bào)道一致[12]。Fabregas等的研究證實(shí),培養(yǎng)液中氮完全消耗時(shí)雨生紅球藻才有明顯地蝦青素積累[13],殷明焱和劉建國的研究也表明,當(dāng)培養(yǎng)液的氮濃度降低至 50μmol以下時(shí)才有蝦青素的積累[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),當(dāng)培養(yǎng)液的硝態(tài)氮含量降至 0.169 mg/L時(shí),雨生紅球藻細(xì)胞開始有蝦青素等次生類胡蘿卜素的合成,這個(gè)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。蝦青素在開始合成的前 4 d積累速度很快,當(dāng)培養(yǎng)基中硝酸鹽含量降至 0.024 mg/L以后其合成速度減慢,這可能是因?yàn)槲r青素的積累需要蛋白質(zhì)的連續(xù)合成,而氮濃度已不足以合成蝦青素積累所需的蛋白質(zhì)[14]。次生類胡蘿卜素的積累清除細(xì)胞內(nèi)因?yàn)槿钡傻难踝杂苫?從而保護(hù)細(xì)胞。由于次生類胡蘿卜的積累使初生類胡蘿卜素β-胡蘿卜素含量的下降,β-胡蘿卜素含量的下降又引起葉黃素含量的下降[15]。

細(xì)胞的生理特性與培養(yǎng)基中氮素含量也有密切的聯(lián)系(表 2)。本實(shí)驗(yàn)在第 7 d培養(yǎng)基中硝酸鹽含量降至 0.169 mg/L,光合速率明顯下降,而呼吸速率上升。光合速率下降是因?yàn)榈拷档揭欢ǔ潭?一方面影響了葉綠素的合成,另外,光合作用碳循環(huán)中各種酶及電子傳遞體的合成受到影響。有許多研究表明,缺氮可限制藻細(xì)胞光合作用[16]。Hagen等認(rèn)為,脅迫條件下細(xì)胞代謝所需能量增加,呼吸作用顯著增強(qiáng)[17,18]。Fv/Fm是 PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量,反映 PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率,雨生紅球藻在整個(gè)培養(yǎng)周期中 Fv/Fm值的變化并不明顯,這與 Erica在氮限制 3 d后研究杜氏鹽藻的結(jié)果不盡一致[19]。NPQ在培養(yǎng)后期有所上升,說明PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散部分增加。這個(gè)結(jié)果與金月梅研究的綠色巴夫藻、小球藻、微綠球藻等 8株微藻的結(jié)果一致[20]。

細(xì)胞的生理特性與色素積累也有密切聯(lián)系 (表2),當(dāng)硝態(tài)氮含量下降到一定的程度,光合效率下降,呼吸速率、NPQ上升,使細(xì)胞內(nèi)能量減少,細(xì)胞生長減緩,以應(yīng)對(duì)脅迫條件。同時(shí)蝦青素積累以清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基,對(duì)細(xì)胞有一個(gè)被動(dòng)的保護(hù)作用。葉綠素含量的下降和蝦青素含量的上升又加劇了光合速率的下降,蝦青素的積累也是呼吸速率上升的原因之一。光抑制和呼吸作用增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基的大量積累,進(jìn)而導(dǎo)致蝦青素的合成及其它生理反應(yīng)[17,18],細(xì)胞呼吸速率、NPQ的上升及光合速率的下降均說明細(xì)胞 PSⅡ活性下降[17,21]。雨生紅球藻在氮脅迫條件下積累蝦青素和細(xì)胞 PSⅡ活性下降是對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)。

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The Dynam ic Change of Pigments and Photosynthetic Physiological Characteristics ofHaem atococcus pluvialisCultures

WANGQun,SANGMin,L IAi-fen＊,ZHANG Cheng-wu

Institute of Hydrobiology?,Jinan University,Guangzhou 510632,China

The dynamic change of pigments,photosynthetic physiological characteristics and nitrate uptake ofHaem atococcus pluvialisCG-06 were investigated.The main pigmentsof green vegetative cellswere composed of chlorophyll,lutein andβ-carotene,however,except above pigments,astaxanthin、echinenone and canthaxanthin were detected in red immobile cells.H.pluvialisassimilated nitrate quickly during exponential growth stage.The nitrogen concentration declined to 4.875 mg/L in 3rdday and decreased to 0.169 mg/L in the 7thday.The astaxanthin inH.pluvialiscultureswas detected on day 7,its content in red cells increase dramatically,which increased from 0.159 mg/g to 1.68 mg/g from 7thday to 11thday accompanying with the dropdown ofβ-carotene.The results also demonstrated that the photosynthetic rate, respiration rate and NPQ remained stable at initial stage,and then the photosynthetic rate declined,while the respiration rate and NPQ increased on day 7.During the whole culture,the Fv/Fm ofH.pluvialisdid not appear obvious variation.

Haem atococcus pluvialis;astaxanthin;carotenoid;nitrate nitrogen;photosynthetic characteristic

1001-6880(2010)05-0850-05

Q949.21;Q17

A

2010-04-28 接受日期:2010-07-06

珠海市科技局項(xiàng)目(PC20081008)

＊通訊作者 Tel:86-20-85224366;E-mail:tiger@jnu.edu.cn