王 萍沈玉華謝安建

(1安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，合肥 230039)

(2安徽省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，合肥 230031)

沙苑子提取液對不同體系中草酸鈣晶體生長影響的研究

王 萍1,2沈玉華＊,1謝安建1

(1安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，合肥 230039)

(2安徽省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，合肥 230031)

通過與水、氯化鈉、正常人尿液體系的比較，重點研究了結(jié)石患者尿液體系中加入中藥沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的的影響，利用SEM，F(xiàn)TIR和XRD等測試手段對所得晶體進(jìn)行表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在結(jié)石患者尿液體系中形成的草酸鈣晶體為一水草酸鈣(COM)晶體，而在這4種體系中加入沙苑子提取液后，只形成二水草酸鈣(COD)晶體，表明沙苑子提取液能抑制COM晶體生長,并且隨著沙苑子提取液濃度增大，抑制作用增強。沙苑子抑制草酸鈣晶體生長的可能機理進(jìn)行了探討。

草酸鈣；泌尿系統(tǒng)結(jié)石；沙苑子；抑制

尿結(jié)石是一種危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其中60%～80%為含草酸鈣的結(jié)石[1-2]，近年來人們從不同角度對尿結(jié)石的形成及抑制因素進(jìn)行廣泛研究[3-6]，但對其作用機理仍然不十分清楚。

中草藥方劑治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石歷史悠久，因其療效顯著，且副作用少等優(yōu)點而備受關(guān)注。近年來人們開始從生物礦化的角度探索單味中草藥對尿結(jié)石形成的影響及其作用機理[7-9]。這種研究對于尋找有效防治尿結(jié)石的藥物具有重要的臨床意義。

研究尿結(jié)石最常見的體系有水溶液、人工尿液以及正常人尿液[10-12]等。由于結(jié)石的形成是建立在有機基質(zhì)調(diào)控的基礎(chǔ)上，尿液中有機分子的物種和濃度在結(jié)石形成過程中起著重要作用[13]，為了更接近體內(nèi)結(jié)石生長的真實環(huán)境，我們選擇正常人和結(jié)石患者尿液體系，研究中藥對草酸鈣晶體生長的影響，并與水體系及氯化鈉體系的晶體生長進(jìn)行比較。

中藥沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Brown)的干燥成熟種子，具有補肝、益腎明目、固精等功效。沙苑子中主要含有氨基酸、黃酮類、三萜類、有機酸等成分。氨基酸中含量最多的為谷氨酸，約占總氨基酸的68%，其次為天冬氨酸，約占14%。黃酮類成分主要為沙苑子苷、沙苑子新苷、山奈酚等[14-16]。據(jù)文獻(xiàn)報道，氨基酸和黃酮對草酸鈣晶體的生長都有一定的影響[17-19]，因此我們選擇該味中藥進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)其可能在治療尿結(jié)石方面的新的功效。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

草酸鈉(北京化工廠)，無水氯化鈣(上海泗聯(lián)化工廠)，疊氮化鈉(浙江東陽天宇化工有限公司)，氯化鈉(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，以上藥品皆為分析純。水為二次水。

沙苑子(Semen Astragali complanali)，豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Brown)的干燥成熟種子。

KYKY-EM3200型掃描電子顯微鏡 (SEM)(北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)觀察晶體形貌，加速電壓20 kV；Y-4Q型X射線衍射儀 (丹東射線儀器工業(yè)公司)測試物相，測試電壓35 kV，電流25 mA，掃描速度 0.06°·s-1。TGL-16G 高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 尿液的處理

收集正常人及尿結(jié)石患者的晨尿，加入2wt%的疊氮化鈉溶液(10 mL·L-1尿樣)防腐，過濾后加入適量0.15 mol·L-1的NaCl溶液稀釋，磁力攪拌使之混合均勻，備用。

1.2.2 沙苑子提取液的制備取沙苑子100 g，洗凈，碾碎，放于2 L燒杯中，加二次水800 mL，煮沸40 min，過濾，濾渣加二次水600 mL，煮沸30 min，過濾。合并2次濾液，濃縮成含生藥濃度為0.5 g·mL-1的沙苑子提取液，用高速離心機離心(16 000 r·min-1)10 min，取上清液，冷藏，用時稀釋成所需濃度。

1.2.3 晶體的生長

1.2.3.1 沙苑子提取液對不同體系中草酸鈣晶體生長的抑制作用

在潔凈的燒杯中加入0.01 mol·L-1的CaCl2溶液20 mL、結(jié)石患者尿液120 mL、生藥濃度為0.01 g·mL-1沙苑子提取液 40 mL 和 0.01 mol·L-1的Na2C2O4溶液20 mL，使，攪拌均勻，放置一片經(jīng)過親水性處理[20]的玻璃片(0.5 cm×0.5 cm)。將燒杯于(10±1)℃恒溫放置 3 d，取出玻璃片進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)測試。燒杯中沉淀離心分離，取出草酸鈣晶體，分別用乙醇和二次水洗滌數(shù)次，干燥后進(jìn)行X射線粉末衍射(XRD)測試。

分別用正常人尿液、二次水、0.15 mol·L-1NaCl溶液替換結(jié)石患者尿液，同法操作，考察沙苑子提取液對不同體系中草酸鈣晶體生長的影響。

1.2.3.2 不同濃度沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長抑制作用的比較

在結(jié)石患者尿液體系中分別加入0.01、0.03、0.05、0.1 g·mL-1沙苑子提取液，按 1.2.3.1 同法操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙苑子提取液對不同體系草酸鈣晶體生長的抑制作用

2.1.1 草酸鈣晶體的SEM圖像

圖1所示為不同體系中生長的草酸鈣晶體的SEM圖像。圖1a、圖1b為結(jié)石患者尿液中不加沙苑子提取液生長的草酸鈣晶體的形貌，圖中只出現(xiàn)了歸屬于COM的六邊形晶體[21]，對角線平均尺寸分別為 8.0、4.8、5.2 μm。

圖1c為在結(jié)石患者尿液中加入0.01 g·mL-1的沙苑子提取液后得到的草酸鈣晶體的SEM圖像?？梢钥闯?，晶體均為歸屬于COD的四方錐形，但晶體大小不等，大晶體對角線平均尺寸為33.3、33.3 μm，小晶體對角線平均尺寸為18.8、18.8 μm。由圖1c可以看出，加入沙苑子提取液后，六邊形的COM晶體消失，說明沙苑子提取液具有抑制COM晶體生長的能力。

圖1d為正常人尿液中加入0.01 g·mL-1的沙苑子提取液生長的草酸鈣晶體形貌圖。在該體系中形成了大小不等的四方錐晶體(歸屬于COD)，大晶體對角線平均尺寸為 12.3、12.3 μm，小晶體對角線平均尺寸為 4.9、4.9 μm。而正常人尿液中生長的草酸鈣晶體通常為COM和COD[17]。表明在正常人尿液中沙苑子提取液對COM晶體的生長也具有較強的抑制作用。

水體系及氯化鈉體系[20]中生長的草酸鈣晶體的形貌均為拉長六邊形的COM，在2個體系中分別加入沙苑子提取液后，六邊形的COM都轉(zhuǎn)變?yōu)樗姆藉F形的COD，但形貌有所不同。水體系中只出現(xiàn)四方錐形晶體(圖 1e)，對角線平均尺寸為 20、20 μm。而氯化鈉體系中既有四方錐晶體，也有小的四方狀晶體(圖 f)，前者對角線平均尺寸為 21.1、24.4 μm，后者對角線平均尺寸為 8.3、8.8 μm。小四方晶體的邊緣比較圓鈍(圖f中圓圈中表示部分)，可能是因為草酸鈣晶體生長是一個沉淀-溶解的動態(tài)過程，沙苑子中有效成分(如氨基酸)與草酸鈣晶體表面的鈣離子配位生成可溶性的配位物而使晶體溶解，而溶解后的鈣離子又可在晶體表面重新沉淀，從而形成圓鈍的晶體。

從圖1中可以看出，在不同體系中加入沙苑子提取液后，六邊形的COM晶體的生長均受到抑制，而只生成了四方錐形的COD。表明沙苑子提取液對COM晶體的形成具有較強抑制作用。

2.1.2 草酸鈣晶體的 XRD圖

圖2所示為不同體系中生長的草酸鈣晶體的XRD圖。與草酸鈣晶體的XRD標(biāo)準(zhǔn)圖譜卡片PDF No.20-0231(一水合草酸鈣)、PDF No.17-0541(二水合草酸鈣)比較，發(fā)現(xiàn)在不同體系中生長的草酸鈣晶型不同。未加沙苑子提取液的結(jié)石患者尿液中只出現(xiàn)了一水合草酸鈣 COM特征峰 (圖 2a)：d值為0.593，0.365 和 0.298 nm，分別歸屬于 COM 的(101)面、(020)面和(202)面。

在結(jié)石患者尿液中加入沙苑子提取液后，COM晶體衍射峰消失，所有衍射峰均由COD晶體產(chǎn)生，分別歸屬于 COD 的(200)面、(211)面、(411)面、(213)等(圖2b)，表明該體系中生長的晶體為COD。

在正常人尿液和水體系中加入沙苑子提取液后所得晶體衍射峰與結(jié)石患者尿液中加入沙苑子提取液后所得的相似，但各峰的相對強弱發(fā)生變化(圖 2c～d)。(411)面衍射峰增強，表明這 2 個體系中晶體主要沿(411)面生長。而在氯化鈉體系中晶體的最強峰由(213)產(chǎn)生，即晶體主要沿(213)面取向生長形成。

2.2 不同濃度沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的影響

2.2.1 草酸鈣晶體的SEM圖像

圖3所示為結(jié)石患者尿液體系中加入不同濃度沙苑子提取液得到的草酸鈣晶體的形貌。圖3a為加入0.01 g·mL-1沙苑子提取液后所成的草酸鈣晶體。圖中均為四方錐形的COD晶體，但晶體大小不等，大晶體對角線平均尺寸為 33.3、33.3 μm，小晶體對角線平均尺寸為 18.8、18.8 μm。

當(dāng)沙苑子提取液的濃度增大到0.03 g·mL-1時，體系中也只形成COD晶體(圖3b)，晶體對角線平均尺寸為 27.8、27.8 μm，晶體比加入 0.01 g·mL-1沙苑子提取液體系中形成的尺寸明顯減小。

當(dāng)沙苑子提取液的濃度增大到0.05 g·mL-1時(圖3c)，所得的四方錐晶體更小，對角線平均尺寸為17.5、17.5 μm。

從以上情況可以看出，隨著沙苑子提取液濃度的增大，草酸鈣晶體尺寸減小，即沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的抑制作用逐漸增強。這可能是由于當(dāng)提取液濃度增大時，其中氨基酸的含量增大，與晶體表面鈣離子的配位能力也增大，晶體生長受到的抑制作用也更強。

隨著沙苑子提取液的濃度增大到0.10 g·mL-1(圖3d)，體系中生成的草酸鈣晶體形貌出現(xiàn)了特殊的變化，大多為不完整的四方錐形晶體，晶體的對角線平均尺寸為 15.9、15.9 μm?？赡苁窃谳^高濃度的沙苑子體系中，沙苑子中有效成分對晶體表面的吸附作用更強，且這種吸附作用對晶體的晶面有較高的選擇性，造成晶體生長過程中某些晶面的生長缺陷，從而得到特殊形態(tài)的COD晶體。

2.2.2 草酸鈣晶體的XRD圖

圖4為加入不同濃度沙苑子提取液的草酸鈣的 XRD圖。圖 4a～d中主要衍射峰的 d值為0.618，0.442，0.278 和 0.224 nm,分別歸屬于 COD 晶體的(200)面、(211)面、(411)面和(213)面，表示不同條件下生成的CaC2O4晶體均為COD。

從譜圖可以看出，圖中主衍射峰的相對強弱不同。圖4a中最強峰由(213)面產(chǎn)生，而圖4b～d中最強峰均由 (200)面產(chǎn)生，即當(dāng)沙苑子濃度較低時，COD晶體主要沿(213)面生長，而隨著沙苑子濃度的增大，COD的(200)面的衍射峰增強。

2.3 沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的抑制機理探討

沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的抑制作用與其所含的主要成份有關(guān)。沙苑子中含有酸性氨基酸谷氨酸及天冬氨酸，兩者的等電點分別為3.22和2.77，因此在提取液中兩者均以帶負(fù)電荷的羧基形式存在，能通過靜電作用與晶體表面的鈣離子配位(見圖5)。根據(jù)溶質(zhì)分子結(jié)晶過程生成晶體的吉布斯自由能公式[22]

C1為溶質(zhì)的過飽和濃度，C0為溶質(zhì)的飽和濃度，Ksp(CaC2O4)=C02，C0=Ksp1/2(CaC2O4)，即在一定溫度下，C0值為一定，ΔG值隨C1增大而減小。由于氨基酸與鈣離子的配位，使極性基團(tuán)周圍的鈣離子濃度增大，而鈣離子又吸引溶液中的草酸根離子，造成局部過飽和度增大，ΔG減小，從而有利于高能COD晶體的生成。因此，在加入沙苑子提取液的體系中只生成COD晶體而沒有COM晶體。

另外，氨基酸與鈣離子的配位也使之吸附在晶體表面，阻礙了草酸根與鈣離子的結(jié)合，即封閉晶體生長點，抑制晶核的聚集及生長。隨著沙苑子濃度增大，這種作用增強，晶體尺寸變小。再有，吸附在晶體表面的氨基酸羧基的負(fù)電荷使晶體表面ζ電位變負(fù)，增加了晶體表面離子之間的排斥作用，使晶體的聚集受到抑制。

草酸鈣晶體生長過程存在著結(jié)晶與溶解的動態(tài)平衡：CaC2O4(s)? Ca2++C2O42-，當(dāng)沙苑子中氨基酸與鈣離子配位后，平衡右移，沉淀溶解，溶液中Ca2+離子和C2O42-離子濃度增大。同時，溶液中還存在帶電荷的氨基酸，這都會使溶液的離子強度增大，促進(jìn)草酸鈣的溶解，使草酸鈣晶體的成核與生長受到抑制。

3 結(jié) 論

在4種不同體系中形成的草酸鈣晶體均存在COM，而在這4種體系中加入沙苑子提取液后，COM晶體消失，都只形成COD晶體，即沙苑子提取液對COM晶體生長具有很強的抑制作用，而COD晶體與腎小管細(xì)胞的接觸程度較小、與腎小管細(xì)胞表面結(jié)合力較弱，比COM更容易隨尿排出體外[13]，故沙苑子提取液有可能預(yù)防尿結(jié)石的形成。

本實驗表明，沙苑子提取液對草酸鈣晶體生長的抑制作用隨著沙苑子提取液濃度增大，抑制作用增強。這種抑制作用除與其含有的氨基酸成分有關(guān)外，也可能與其含有的黃酮類及其它多種成分的協(xié)同作用有關(guān)，其作用機理有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Extract of Semen Astragali Complanali on Calcium Oxalate Crystal Growth in Different Systems

WANG Ping1,2SHEN Yu-Hua＊,1XIE An-Jian1
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Anhui Universitry,Hefei 230039)
(2School of Pharmacy,Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230031)

The growth of CaC2O4crystals in the diluted urine of urinary lithiasis patients with different concentrations of Semen Astragali Complanali(SAC)extract was investigated by comparing with the crystallization in different systems such as pure water,sodium chloride aqueous solution and diluted healthy urine.The gained crystals were characterized by scanning electron microscope(SEM),Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)and X-ray diffraction(XRD).The results showed that calcium oxalate monohydrate(COM)crystals were the dominant phase in the diluted pathological urine,while there were only calcium oxalate dihydrate(COD)crystals after the addtion of extract of SAC in the above four systems.It indicated that SAC could prohibit the growth of calcium oxalate,and the prevention ability of SAC from the formation of COM crystals increased along with the increase of the extract concentration.The inhibition mechanism of SAC to the crystal growth of calcium oxalate was also discussed.

calcium oxalate;urinary stone;Semen Astragali Complanali;inhibition

O614.23+1；R282.7

A

1001-4861(2010)06-1089-06

2009-09-21。收修改稿日期：2010-03-12。

國家自然科學(xué)基金(No.20671001，20871001)，安徽省教育廳重大項目(No.ZD2007004-1)，高校博士點基金(No.20070357002)及安徽省功能無機材料化學(xué)重點實驗室基金資助。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：s_yuhua@163.com

王 萍，女，43歲，在職碩士研究生，講師；研究方向：生物無機化學(xué)。