張赟彬，繆存鉛，宋 慶，郭 媛

荷葉精油對(duì)肉類食品中常見致病菌的抑菌機(jī)理

張赟彬1，繆存鉛1，宋 慶2，郭 媛1

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200235；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

目的：研究荷葉精油對(duì)肉類食品中常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌機(jī)理。方法：測(cè)定菌懸液電導(dǎo)率、還原糖含量及蛋白質(zhì)含量變化。結(jié)果：電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)荷葉精油質(zhì)量濃度達(dá)40mg/mL時(shí)，5min即可導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率明顯增加；還原糖實(shí)驗(yàn)中，荷葉精油對(duì)3種細(xì)菌作用后菌液中還原糖含量逐漸增大，作用3h時(shí)增加最多；經(jīng)荷葉精油處理一段時(shí)間后，可溶性蛋白含量有所下降，下降幅度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。結(jié)論：荷葉精油可造成菌體細(xì)胞膜透性的變化，引起3種菌體內(nèi)含物的滲漏，從而造成液體培養(yǎng)基電導(dǎo)率和還原糖含量增加；可溶性蛋白實(shí)驗(yàn)表明荷葉精油可使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成速率受到抑制。

荷葉精油；肉類食品；致病菌；抑菌機(jī)理；電導(dǎo)率

近幾年，化學(xué)合成抗菌劑的安全性越來(lái)越受到人們關(guān)注，隨著生活水平的不斷提高，人們更加追求綠色、安全、天然的食品抗菌劑。大量研究表明，植物精油對(duì)微生物具有較強(qiáng)的抑制作用[1-3]，而其中從香辛料中提取的植物精油由于兼具香味和抗菌活性，在肉類食品的防腐方面已經(jīng)有不少報(bào)道[4-5]。荷葉是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用植物，安全性高，前期對(duì)荷葉精油的研究表明，荷葉精油具有較強(qiáng)的抗菌性[6-7]，但其相關(guān)抗菌機(jī)理的研究至今未見報(bào)道。

許多植物精油對(duì)微生物都具有較強(qiáng)的抑制作用，其抗菌作用機(jī)理大致可以分為：降解細(xì)胞壁[8]、破壞細(xì)胞質(zhì)膜[9]、破壞膜蛋白[10]、胞內(nèi)成分滲出[11]、胞質(zhì)凝結(jié)[12]、分子主動(dòng)運(yùn)輸力損耗[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究荷葉精油作用于肉類食品中常見的3種致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，以探討荷葉精油的抗菌機(jī)理，為將荷葉精油開發(fā)成為天然抑菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉為浙江溫嶺澤國(guó)鎮(zhèn)下店村荷塘的雙塘雪藕品種，選取大小色澤均勻的荷葉，于葉柄處剪斷，日曬干燥后保藏。實(shí)驗(yàn)時(shí)取保藏荷葉剪碎后，再用小型粉碎機(jī)粉碎成粉末狀樣品，過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩后使用。

Tris、85g/100mL磷酸、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白(BSA)、硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DJ靈巧型粉碎機(jī) 上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YX-160B型手提式壓力蒸氣滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠；DDS-307型電導(dǎo)率儀 上海偉業(yè)儀器廠；JY2001型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；沙門氏菌購(gòu)于上海盛思生化科技有限公司。

乳糖膽鹽培養(yǎng)基(增菌大腸桿菌)：蛋白胨20.0g、膽鹽5.0g、乳糖10.0g、溴甲酚紫0.01g，加蒸餾水1000mL加熱溶解，分裝，經(jīng)115℃、20min滅菌后備用；7.5g/100mL氯化鈉肉湯(增菌金黃色葡萄球菌)：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化鈉75.0g、加蒸餾水1000mL加熱溶解，分裝，經(jīng)115℃、20min滅菌后備用；四六磺酸鈉亮綠增菌液(TTB，增菌沙門氏菌)：蛋白胨5.0g、硫代硫酸鈉30.0g、牛膽鹽1.0g、碳酸鈣10.0g、加蒸餾水1000mL加熱溶解，分裝，經(jīng)121℃、20min滅菌后備用。

1.4 方法

1.4.1 荷葉精油的制備

稱取一定量荷葉粉，過(guò)60目篩，移入500mL單口燒瓶，按料液比1:10(m/V)加入蒸餾水，于1L單口燒瓶?jī)?nèi)浸泡1h，電爐加熱至沸騰；同時(shí)用50℃水浴加熱乙醚使其沸騰，蒸餾萃取90min結(jié)束，將油水分離器中的溶液全部倒回溶劑瓶，在－20℃冰箱冷藏過(guò)夜除水；將乙醚倒入梨形蒸餾瓶于55℃水浴加熱下，用精餾塔(環(huán)形填料)濃縮回收溶劑，直到無(wú)餾出液，剩余液(淡黃色)收集于棕色精油瓶，于4℃冰箱冷藏保存，待用。

1.4.2 不同菌種菌落總數(shù)-OD600nm值的測(cè)定

不同菌種于特定培養(yǎng)基增菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h，吸取1mL 菌液于9mL無(wú)菌水10倍稀釋，相同操作稀釋至10-7，不同濃度菌液各取1mL用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落總數(shù)，同時(shí)對(duì)不同濃度菌液用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定不同菌種菌落總數(shù)-OD600nm值曲線，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.3 菌液電導(dǎo)率測(cè)定[14]

用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌液OD600nm值，吸取0.5mL菌液放入15mL試管中，加入10mL去離子水和一定量荷葉精油，使荷葉精油的質(zhì)量濃度分別為0、1、10、40mg/mL，然后分別在0、5、15、30、60、90、180min時(shí)測(cè)定其電導(dǎo)率，平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值。選取電導(dǎo)率變化較大的荷葉精油質(zhì)量濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

1.4.4 菌液還原糖含量測(cè)定

菌懸液配制：用無(wú)菌水調(diào)菌液的OD600nm值，吸取2mL菌液至乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔1h取出，在7000r/min離心10min，取上層清液測(cè)定。

直接滴定法[15]測(cè)定還原糖含量：吸取5.0mL堿性酒石酸銅甲液及5.0mL乙液，置于150mL錐形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠兩粒，從滴定管加入比預(yù)測(cè)體積少1mL的試樣溶液至錐形瓶中，使在2min內(nèi)加熱至沸騰，趁沸繼續(xù)以每?jī)擅胍坏蔚乃俾实味?，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，平行操作3次。

1.4.5 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定

供試菌蛋白質(zhì)提?。河脽o(wú)菌水調(diào)節(jié)菌液OD600nm值，吸取菌液10mL，加入一定量相同濃度的荷葉精油，分別處理4、8、16、32、64h，以不加荷葉精油作為對(duì)照，收集菌液，準(zhǔn)確稱取各處理樣品3mL，在－20℃冰箱中冷凍過(guò)夜。在荷葉精油中加入5倍體積的0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液，－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

[14]方法繪制牛血清蛋白濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品蛋白質(zhì)的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.1mL各處理樣品于10mL具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G250染色劑，混勻后放置2min，用10mm厚的比色杯在波長(zhǎng)595nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)樣品的蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉精油對(duì)不同菌液細(xì)胞膜滲透性的影響

2.1.1 荷葉精油對(duì)沙門氏菌細(xì)胞膜滲透性的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度荷葉精油對(duì)沙門氏菌菌懸液電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of essential oil from lotus leaves on electrical conductivity of Salmonella cell suspension

由圖1可知，不加荷葉精油的菌液中電導(dǎo)率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而漸漸升高，但是總體變化量不大，0min時(shí)，菌液中電導(dǎo)率為112.3μS/cm，而180min時(shí)，菌液中的電導(dǎo)率為131.2μS/cm。荷葉精油處理使菌液中電導(dǎo)率上升作用明顯，經(jīng)荷葉精油作用5min后，沙門氏菌菌液中的電導(dǎo)率得到明顯增加，1mg/mL荷葉精油處理后在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到145μS/cm以上，而40mg/mL荷葉精油處理后最大電導(dǎo)率上升到165μS/cm，結(jié)果表明這些抑菌成分在作用5min后，沙門氏菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)可能受到一定破壞，導(dǎo)致小分子的離子(K+、Ca2+、Na+等)從細(xì)菌細(xì)胞中大量滲出，從而增加了菌液的電導(dǎo)率上升；15min后，菌液的總體電導(dǎo)率變化不大。

2.1.2 荷葉精油對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透性的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度荷葉精油對(duì)金黃色葡萄球菌菌懸液電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of essential oil from lotus leaves on electrical conductivity of Staphylococcus aureus cell suspension

圖2 表明，不加抑菌成分的菌液中電導(dǎo)率總體變化量不大，0min時(shí)，菌液電導(dǎo)率為116.3μS/cm，而180min時(shí)，菌液的電導(dǎo)率為129.5μS/cm；而經(jīng)荷葉精油作用5min后，菌液的電導(dǎo)率有了明顯變化，1mg/mL荷葉精油處理后，短時(shí)間內(nèi)菌液的電導(dǎo)率增加到140μS/cm，而經(jīng)40mg/mL荷葉精油處理后電導(dǎo)率最大達(dá)到170μS/cm，圖2顯示這些抑菌成分在作用5min時(shí)，已經(jīng)一定程度上破壞了金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小分子的離子從細(xì)胞中大量滲出，從而增加了菌液的電導(dǎo)率。

2.1.3 荷葉精油對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜滲透性的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度荷葉精油對(duì)大腸桿菌菌懸液電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of essential oil from lotus leaves on electrical conductivity of E. coli cell suspension

由圖3可見，不加抑菌成分的菌液中電導(dǎo)率有所增加，但總體變化量不大，0min時(shí)，菌液中電導(dǎo)率為116.3μS/cm，而180min時(shí)，菌液中電導(dǎo)率為128.5μS/cm；而經(jīng)荷葉精油作用5min后，菌液的電導(dǎo)率有了明顯變化，1mg/mL荷葉精油處理后電導(dǎo)率最大值達(dá)180μS/cm，表明荷葉精油對(duì)大腸桿菌菌液作用5min時(shí)，一定程度上破壞了大腸桿菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌細(xì)胞中的離子大量滲出。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷葉精油可造成3種菌體內(nèi)含物的滲漏，引起菌體細(xì)胞膜透性的變化，從而造成液體培養(yǎng)基電導(dǎo)率增加；從電導(dǎo)率的最大值看，荷葉精油對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜滲透性影響最大，金黃色葡萄球菌稍弱，沙門氏菌影響最小。但是荷葉精油質(zhì)量濃度的增加對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的滲透性影響更為顯著，而對(duì)大腸桿菌的滲透性影響較小。總而言之，荷葉精油對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜滲透性影響最大，但隨著質(zhì)量濃度的上升，三者作用效果接近。確定后續(xù)還原糖含量測(cè)定和可溶性蛋白含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)的荷葉精油質(zhì)量濃度為40mg/mL。

2.2 荷葉精油對(duì)不同菌液還原糖含量的影響

圖4 荷葉精油對(duì)不同菌液還原糖含量的影響Fig.4 Effect of essential oil from lotus leaves on reducing sugar contents in different bacterial suspensions

由圖4可以看出，經(jīng)過(guò)40mg/mL荷葉精油處理2h后，各菌液中的還原糖含量均出現(xiàn)先增加后減小的現(xiàn)象，作用3h時(shí)，還原糖含量達(dá)到最高點(diǎn)，尤其以大腸桿菌菌液最為明顯，達(dá)到0.74g/100g，隨后還原糖含量又隨時(shí)間的增加而逐漸減少，原因可能是由于存活的細(xì)菌仍進(jìn)行呼吸作用消耗掉還原糖。同時(shí)，隨著荷葉精油對(duì)菌液處理時(shí)間的增加，3種菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步受到破壞，能使分子質(zhì)量較大的還原糖得以通過(guò)細(xì)胞膜滲出。對(duì)比3種菌體的還原糖含量變化，滲漏到胞外的還原糖含量以大腸桿菌菌液最多，金黃色葡萄球菌次之，沙門氏菌最少，說(shuō)明在相同質(zhì)量濃度下荷葉精油對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞最顯著，金黃色葡萄球菌次之，對(duì)沙門氏菌的抑制作用最小。

2.3 荷葉精油對(duì)不同菌液可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖5 蛋白質(zhì)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for protein quantification

由圖5可看出，牛血清蛋白質(zhì)的吸光度隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并且其數(shù)值變化趨于直線，其線性回歸方程為：y=0.5725x－0.0212，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)樣品的可溶性蛋白質(zhì)含量見圖6。

圖6 荷葉精油對(duì)不同菌種可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.6 Effect of essential oil from lotus leaves on soluble protein contents in different bacterial suspensions

由圖6可知，40mg/mL荷葉精油對(duì)3種菌懸液的作用，0～4h時(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量有較大幅度的減小，隨后可溶性蛋白含量有所增加但增幅不大，表明荷葉精油處理可能對(duì)各細(xì)菌產(chǎn)生影響，抑制其蛋白質(zhì)合成的速率；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，荷葉精油的有效抑菌成分受到破壞，同時(shí)液體培養(yǎng)基中本身含有的蛋白質(zhì)被細(xì)菌生命活動(dòng)所消耗，在處理32h后可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到平衡。

由測(cè)定溶液中可溶性蛋白質(zhì)含量變化可知，金黃色葡萄球和大腸桿菌菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量相當(dāng)，沙門氏菌菌液則較低，表明荷葉精油對(duì)3種菌體蛋白質(zhì)合成的抑制作用大小不一，對(duì)前兩種細(xì)菌的抑制效果更強(qiáng)。

3 結(jié) 論

荷葉精油對(duì)3種菌菌懸液電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果表明，加入荷葉精油培養(yǎng)一定時(shí)間后，培養(yǎng)基的電導(dǎo)率明顯增加，說(shuō)明菌體內(nèi)有電解質(zhì)滲漏。當(dāng)荷葉精油質(zhì)量濃度達(dá)40mg/mL時(shí)，電導(dǎo)率增加最為明顯，說(shuō)明荷葉精油能造成3種細(xì)菌內(nèi)含物的滲漏，引起菌體細(xì)胞膜透性的變化，從而造成液體培養(yǎng)基電導(dǎo)率增加；還原糖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷葉精油對(duì)3種細(xì)菌作用3h時(shí)，還原糖含量增加最多，表明此時(shí)菌體細(xì)胞膜已造成相當(dāng)程度的破壞，足以讓分子體積較大的還原糖類物質(zhì)滲出；經(jīng)荷葉精油處理一段時(shí)間后，可溶性蛋白含量有所下降，下降幅度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明細(xì)菌蛋白質(zhì)合成速率受到抑制；綜合上述三方面實(shí)驗(yàn)，表明荷葉精油對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌次之，沙門氏菌最弱。

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Anti-bacterial Mechanism of Essential Oil from Lotus Leaves on Commonly Found Pathogens in Meat Foods

ZHANG Yun-bin1，MIAO Cun-qian1，SONG Qing2，GUO Yuan1
(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200235, China；2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

In order to elucidate the inhibitory mechanism of the essential oil from lotus leaves on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella commonly found in meat foods, the effect of the presence of the oil on the cell membrane permeability, electrical conductivity and reducing sugar and protein contents of the bacterial suspensions of these microorganisms was examined. All the bacterial suspensions presented higher electrical conductivity 5 min after addition of the oil, and their reducing sugar contents after addition of the oil decreased during the first two hours, followed by initial increase up to a climax at three hours and then decrease. During the first four hours of treatment with the oil, the soluble protein contents of the three bacterial suspensions decreased, and the subsequent change trend was initially increase up to a climax at eight hours, followed by decrease. In conclusion, the presence of the oil causes the change of cell membrane permeability and as a result, the leakage of cell contents happens to these three bacteria so that both conductivity and reducing sugar content increase. Moreover, the oil can delay protein synthesis in bacterial cells.

lotus oil；meat product；pathogenic bacteria；antibacterial mechanism；electrical conductivity

Q949.746.1

A

1002-6630(2010)19-0063-04

2009-12-09

上海市教委重點(diǎn)項(xiàng)目(07ZZ165)

張赟彬(1973—)，男，教授，博士，主要從事植物中活性物質(zhì)的分離提取研究。E-mail：ybzhang@sit.edu.cn