張國威，鄒偉，劉芳，郭新年，趙佳輝，孫曉偉，李丹，于學(xué)平，滕秀英，王瓏，滕偉

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010;4.黑龍江省康復(fù)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150018;5.黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150036;6.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，約80%發(fā)生于大腦半球(基底節(jié)70%、腦葉10%)，其余20%發(fā)生于腦干和小腦，約占全部腦卒中的20%～30%。急性期病死率約30% ～40%，是腦血管病中發(fā)病急、病情重、死亡率高、致殘率高的疾病［1］。本實(shí)驗(yàn)通過自體血注入法制備腦出血大鼠模型;針刺組大鼠針刺患側(cè)百會(huì)透曲鬢穴;運(yùn)用免疫組化等檢測(cè)方法，動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)間點(diǎn)針刺頭部腧穴對(duì)腦組織中AQP－4陽性細(xì)胞表達(dá)的影響，探討針刺頭部腧穴對(duì)腦出血大鼠腦水腫的拮抗作用，為腦出血的治療開辟新的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠160只，體重(350±20)g，由哈爾濱市獸醫(yī)研究所提供(符合國家二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物質(zhì)量合格證書號(hào):SCXK(黑)20060021)。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境濕度45%～65%，溫度22～25℃。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 健康雄性Wistar大鼠160只，體重(350±20)g。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)1w。造模前禁食12h，禁水6h。隨機(jī)分為三組:模型組、針刺組、西藥組，每組50 只大鼠;每組再隨機(jī)分為 6h、1d、2d、3d、7d 五個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠;制備腦出血模型;另設(shè)10只正常大鼠作為空白組。

1.2.2 模型制備 根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［2］確定右側(cè)尾殼核(caudate－putamen nucleus，CPu)位置。參照Rosenberg［3］等報(bào)道的方法制作腦出血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛(350mg·kg－1)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，使上門齒鉤平面比耳間線平面低2.4mm，這樣大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取頭皮正中，備皮消毒，正中切口，長度約1cm，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點(diǎn)(Bregma點(diǎn))右旁開3.5mm，后0.2mm定點(diǎn)，用牙科鉆鉆直徑為1.0mm的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3cm處剪斷鼠尾，用微量注射器取血50ul，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔垂直進(jìn)針約6mm，將未肝素化的血液50ul以25ul·min－1速度推進(jìn)尾殼核，留針約2min，緩慢出針。留針期間酒精棉球包扎鼠尾斷端傷口。術(shù)后局部噴灑慶大霉素，用牙科水泥封閉顱骨創(chuàng)口，縫合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒，防止局部感染影響指標(biāo)觀察。

1.2.3 篩選成功模型的方法 大鼠造模完成，待大鼠清醒，采用 Berderson［4］評(píng)分法。

篩選成功模型動(dòng)物。根據(jù)Berderson神經(jīng)體征評(píng)分法:輕抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分:無神經(jīng)功能缺損;1分:腦部病變對(duì)側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲;2分:上述體征+向麻痹側(cè)推阻力下降;3分:活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)打圈(呈追尾狀)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法 針刺組針刺患側(cè)“百會(huì)”透“曲鬢”穴，30min·次－1，每天1次。針刺方法:大鼠捆綁固定，用28號(hào)1寸毫針針刺患側(cè)百會(huì)穴透曲鬢穴，取穴方法參照華興邦等［5］制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》，進(jìn)針0.8寸，留針30min，期間捻轉(zhuǎn)3次，每次5 min，以200r·min－1速度捻針。西藥組給予憶立福稀釋液1ml灌胃(按人:大鼠體重為200∶1配置)治療，每天3次。模型組大鼠于腦出血造模及評(píng)分后，給予大鼠類針刺組相同捆綁30min·d－1;類西藥組生理鹽水1ml灌胃，每天3次。空白組不做任何干預(yù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示。各實(shí)驗(yàn)組間以及時(shí)間點(diǎn)的比較采用均值比較，一維方差分析，因子和因變量列，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。以P<0.01或P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 為保證篩選成功模型及足量雄性Wistar大鼠能進(jìn)入結(jié)果分析，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了雙倍造模，剔除不成功模型及死亡的大鼠，保證了每個(gè)亞組隨機(jī)足量大鼠進(jìn)入了最終的結(jié)果分析，無脫失值。

2.2 各組大鼠AQP－4陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下，DAB顯色陽性細(xì)胞呈棕黃色或褐色，采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，每張片隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)腦出血區(qū)血腫周邊5個(gè)不重復(fù)視野，在400倍視野下，攝入圖像分析系統(tǒng)，選擇免疫組化分析模塊，通過灰度調(diào)節(jié)，區(qū)分視野內(nèi)陽性信號(hào)面積并結(jié)合目測(cè)進(jìn)行分析，計(jì)算陽性細(xì)胞總數(shù)。AQP－4陽性細(xì)胞主要表達(dá)在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、室管膜上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(足突)。陽性細(xì)胞為空泡狀且主要染色在細(xì)胞膜上，胞漿及胞核幾乎未見染色。

空白組大鼠可見到較豐富的AQP－4陽性細(xì)胞表達(dá)，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)均勢(shì)現(xiàn)象，在個(gè)別神經(jīng)元細(xì)胞膜上有微量表達(dá)。各造模組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的AQP－4陽性表達(dá)上升現(xiàn)象，除7d針刺組，其余造模組與空白組比較差異顯著(P<0.01)。7d針刺組AQP－4陽性細(xì)胞雖然在數(shù)量與空白組差別不大，但在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上反應(yīng)稍弱。模型組大鼠術(shù)后6h即出現(xiàn)AQP－4陽性細(xì)胞表達(dá)增多，并呈現(xiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性增多趨勢(shì);1d明顯增多;2d時(shí)大量表達(dá);3d時(shí)主要為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性反應(yīng)并達(dá)高峰，膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)相對(duì)少;7d時(shí)在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)又逐漸呈現(xiàn)均勢(shì)現(xiàn)象，陽性細(xì)胞仍高于空白組。在6h時(shí)間點(diǎn)，針刺組AQP－4陽性表達(dá)均較模型組及西藥組減少，與模型組比較有差異(P<0.05)。針刺組與模型組1d、2d、3d、7d時(shí)間點(diǎn)比較，針刺組 AQP－4陽性表達(dá)均較模型組明顯減少(P<0.01)。針刺組與西藥組1d、2d、3d時(shí)間點(diǎn)比較，均有顯著差異(P<0.01);6h、7d時(shí)間點(diǎn)比較，差異不明顯。西藥組與模型組比較，2d時(shí)稍有差異(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠AQP－4陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s)

表1 各組大鼠AQP－4陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s)

注:各造模組與空白組比較，△P<0.01;針刺組與模型組比較，*P<0.01;針刺組與西藥組比較，*★P<0.01;西藥組與模型組比較，ωP<0.05。

6h 1d 2d 3d 7d空白組 10 39.38±5.05 39.38±5.05 39.38±5.05 39.38±5組別 例數(shù).05 39.38±5.05模型組 50 55.98±6.40△ 71.62±6.44△ 86.90±7.42△ 93.72±7.23△ 54.88±6.99△西藥組 50 52.10±6.71△ 68.72±5.91△ 79.82±5.30△ω 89.12±6.69△ 50.14±6.49△針刺組 50 49.84±4.43△ 53.10±5.26△*★ 63.22±5.60△*★ 65.00±5.90△*★ 45.54±6.49*

3 討論

3.1 頭針療法在腦出血急性期應(yīng)用的可行性探討

頭針療法是以針刺頭皮上的特定區(qū)、線，用來治療病證的一種療法，又稱“頭皮針療法”、“顱針療法”［6］。孫申田等［7］觀察到針刺百會(huì)透曲鬢穴，中風(fēng)患者的腦血流圖有非常顯著的改善，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其變化與手法捻轉(zhuǎn)頻率、刺激強(qiáng)度及作用時(shí)間等，關(guān)系十分密切。鄒氏等［8，9］通過復(fù)制急性高血壓腦出血大鼠模型，觀察針刺對(duì)血漿內(nèi)皮素(ET)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的影響，得出結(jié)論:針刺可以通過抑制血管ET和促進(jìn)CGRP的釋放及其生物活性的作用達(dá)到治療急性高血壓腦出血的目的。頭針療法作為治療中風(fēng)病的有效方法，在急性腦出血的治療方面更是一個(gè)有待深入探討、前景廣闊的研究領(lǐng)域。

3.2 頭穴透刺對(duì)腦出血大鼠腦組織AQP－4表達(dá)影響的探討

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是上世紀(jì)九十年代初開始陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一類跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白家族，是水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要分子基礎(chǔ)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水的平衡，又稱水通道蛋白(water channel protein)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13種水孔蛋白(AQP0－AQP12)［9］。AQP－4主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障和腦－腦脊液屏障的膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜上皮細(xì)胞，其中膠質(zhì)細(xì)胞足突表達(dá)最密集，是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［10，11］。在缺血、出血、外傷、腫瘤等各種原因引起的腦水腫中發(fā)揮重要作用［12］。

Taniguchi等［13］研究了大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后AQP－4mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1d梗死灶周圍皮質(zhì)AQP－4 mRNA的表達(dá)上調(diào)，第3d達(dá)高峰，第7d仍處于較高水平，這種變化與MRI顯示的腦水腫形成和消散相一致。Vizuete等［14］研究發(fā)現(xiàn)，立體定向注入喹啉(quinoline)可誘導(dǎo)病灶區(qū)及同側(cè)紋狀體AQP－4mRNA水平升高，其升高來源于活化的肥大膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)合Evans藍(lán)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，同側(cè)紋狀體區(qū)血腦屏障已破壞，但無神經(jīng)元變性。提示AQP－4的升高與同側(cè)紋狀體血腦屏障的破壞相關(guān)，具有促進(jìn)腦水腫的作用。周氏等［15］在腦出血大鼠血腫周圍組織水孔蛋白－4表達(dá)分析的研究中發(fā)現(xiàn)，腦出血(ICH)6h后血腫周圍組織鄰近毛細(xì)血管的AQP－4蛋白表達(dá)開始增高，于腦出血第1～3d達(dá)高峰期，之后逐漸下降，至第7d仍高于正常水平。在出血側(cè)皮質(zhì)AQP－4蛋白表達(dá)亦相應(yīng)增加，但不如血腫周圍組織明顯。得出結(jié)論:ICH時(shí)血腫成分可誘導(dǎo)AQP－4蛋白表達(dá)增加，腦毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足表達(dá)增強(qiáng)的AQP－4蛋白可能促進(jìn)水通過血－腦脊液屏障向腦實(shí)質(zhì)流動(dòng)，直接參與ICH后血管源性腦水腫的形成。以上這些研究提示AQP－4參與腦水腫的形成，抑制AQP－4可望為減輕各種腦病所致的腦水腫提供新的科研思路和治療途徑。

我們分析認(rèn)為，腦出血后在血腫周圍存在明顯的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP－4陽性反應(yīng)性增多，說明ICH時(shí)可誘導(dǎo)AQP－4蛋白表達(dá)增加，3d時(shí)主要為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性反應(yīng)并達(dá)高峰，與腦水腫高峰一致，說明AQP－4可能主要參與腦水腫損傷機(jī)制。針刺能抑制AQP－4蛋白表達(dá)，表明針刺通過抑制AQP－4蛋白合成和分泌，減輕腦出血后AQP－4導(dǎo)致的腦水腫。我們推測(cè)其機(jī)制可能為:針刺通過抑制AQP－4蛋白合成和分泌，部分阻斷AQP－4參與的ICH后血管源性腦水腫的形成，降低水通過血－腦脊液屏障向腦實(shí)質(zhì)流動(dòng)而發(fā)揮拮抗腦水腫作用;針刺也可能通過降低或減弱AQP－4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來發(fā)揮拮抗腦水腫作用;針刺也可能通過保護(hù)血－腦脊液屏障途徑反過來減弱AQP－4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)，其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。得出結(jié)論:頭針療法在腦出血急性期可能通過抑制內(nèi)源性AQP－4表達(dá)發(fā)揮對(duì)腦水腫的拮抗作用;西藥組無效。

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附圖:AQP－4陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(400倍)