湯 球，崔淑芳，蔡麗萍，江鵬亮

(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，上海 200433)

雞胚宮頸癌模型的建立及其生物學(xué)特性

湯 球，崔淑芳，蔡麗萍，江鵬亮

(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，上海 200433)

目的 建立人宮頸癌雞胚模型，探討其形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性。方法 將Hela細(xì)胞接種于雞胚絨毛尿囊膜，觀察影響宮頸癌雞胚移植瘤成活可能的因素、移植瘤生長(zhǎng)特性、形態(tài)、生物學(xué)特性。結(jié)果 成功建立了人宮頸癌雞胚移植瘤模型。移植后瘤易于生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的血管誘導(dǎo)作用。光鏡下顯示移植后瘤具有與人宮頸癌相似的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論 該模型容易建立，能動(dòng)態(tài)觀察宮頸癌誘導(dǎo)血管生成的全過(guò)程，可用于宮頸癌的實(shí)驗(yàn)研究。

宮頸癌;雞胚尿囊膜;血管生成

宮頸癌是全球發(fā)病率居第二位的婦女惡性腫瘤，每年都有幾十萬(wàn)婦女死于宮頸癌［1］，目前治療手段仍有不足之處，急需研究合理的綜合治療方案。建立宮頸癌動(dòng)物模型，對(duì)進(jìn)一步了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制有著十分重要的作用，從而對(duì)臨床中有效預(yù)防和治療宮頸癌將起關(guān)鍵作用。本研究擬運(yùn)用人宮頸癌Hela細(xì)胞，建立人宮頸癌雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型，并探討其生物學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng)與雞胚孵育

人宮頸癌Hela細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室贈(zèng)送，常規(guī)方法復(fù)蘇HELA細(xì)胞，接種于含為0.1(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和100 U/mL的青霉素的 RPMI－1640 培養(yǎng)液中，置于37.0℃，0.05(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞。德國(guó)伊沙雞種，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)養(yǎng)雞場(chǎng)，受精雞種蛋經(jīng)消毒放入于溫度37.0℃，相對(duì)濕度60%～80%的恒溫孵箱中孵育，胚頭斜向上方，雞蛋長(zhǎng)軸與蛋托約成45°，每天前俯后仰翻蛋3次，孵育備用。

1.2 Hela細(xì)胞接種

在超凈工作臺(tái)上在胚蛋氣室上方開(kāi)直徑約3mm圓形小孔，在胚頭下方1.0cm處開(kāi)窗，大小約1.0cm×1.0cm，負(fù)壓吸引氣室上方小孔，開(kāi)窗處分離殼膜。用微量加樣器準(zhǔn)確吸取一定體積的宮頸癌Hela細(xì)胞懸液，接種至相對(duì)無(wú)血管區(qū)，滅菌透明膠帶封閉窗口，繼續(xù)孵育。操作方法參考王利宏［2］，但有適當(dāng)改進(jìn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理

1.3.1 Hela細(xì)胞接種數(shù)量的影響:取孵育較好的一周齡胚蛋30只，隨機(jī)分為5組，每組6只。用0.01 mol/L PBS稀釋液將Hela細(xì)胞濃度調(diào)整為每0.1mL含細(xì)胞數(shù)量分別為1.0×106，2.0×106，4.0×106，8.0×106個(gè)，4種不同濃度的細(xì)胞懸液分別接種4組雞胚絨毛尿囊膜(按接種細(xì)胞數(shù)量由低至高分別接種至 A，B，C，D四組)，每胚蛋接種0.1mL。對(duì)照組每只接種PBS稀釋液0.1mL。接種后繼續(xù)孵育7 d，以接種區(qū)為中心，直徑3cm取下雞胚絨毛尿囊膜。以可見(jiàn)胚胎活動(dòng)判斷為雞胚存活情況，觀察接種區(qū)腫瘤大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)瘤體長(zhǎng)徑(a)、寬徑(b)，長(zhǎng)徑≥2mm判為成瘤陽(yáng)性。

1.3.2 雞胚胚齡的影響:分別取孵育7、9、11、14 d的胚蛋各6只，每只接種含4.0×106個(gè)細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞懸液0.1mL后，繼續(xù)孵育一周，觀察并記錄雞胚存活與成瘤情況。

1.4 形態(tài)觀察

鏡下觀察:取移植瘤樣本，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片及HE染色后光鏡下觀察各自形態(tài)。

1.5 血管生成情況觀察

取孵育良好的11日齡胚蛋24只并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)和對(duì)照兩組。實(shí)驗(yàn)組每只接種含4.0×106個(gè)細(xì)胞的懸液0.1mL，對(duì)照組每只接種 PBS緩沖液0.1mL。接種后每日每組取3只胚蛋，以移植瘤(或接種區(qū))為中，直徑3cm取絨毛尿囊膜，平鋪于透明的大玻璃片上，解剖顯微鏡下觀察移植瘤誘導(dǎo)的血管生成情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 接種宮頸癌細(xì)胞數(shù)量對(duì)雞胚存活率和移植瘤成瘤率的影響

雞胚存活率與接種細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，每胚蛋接種細(xì)胞數(shù)為8.0×106個(gè)時(shí)，雞胚存活率顯著低于1.0×106組和2.0×106組，對(duì)照組雞胚全部存活。成瘤陽(yáng)性率隨接種細(xì)胞數(shù)量的增加而升高，接種細(xì)胞數(shù)量為每胚蛋2.0×106或4.0×106個(gè)時(shí)，成瘤陽(yáng)性率高于1.0×106組，但接種細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增加至每胚蛋8.0×106個(gè)時(shí)，成瘤陽(yáng)性率亦隨之降低。對(duì)照組未見(jiàn)成瘤(表1)。

表1 接種宮頸癌細(xì)胞數(shù)量對(duì)雞胚存活率和移植瘤成瘤率的影響Tab.1 Effects of the number of inoculated cervical cancer cells on the survival rate of chicken embryos and the tumor formation rate

2.2 接種雞胚胚齡對(duì)雞胚存活率和移植瘤成瘤率的影響

雞胚存活率與接種時(shí)的胚齡成正相關(guān)，7日齡雞胚組接種時(shí)，雞胚存活率顯著低于11日齡、14日齡雞胚組(P ＜0.05)。11日齡、14日齡雞胚接種時(shí)，成瘤陽(yáng)性率顯著高于7日齡雞胚組(P＜0.05)。11日齡雞胚組成瘤率高于14日齡，但差異不顯著(表2)。

表2 接種雞胚胚齡對(duì)雞胚存活率和移植瘤成瘤率的影響Tab.2 Effects of embryonic age on the survival rate of chicken embryos and the tumor formation rate

2.3 移植瘤形態(tài)觀察

肉眼見(jiàn)宮頸癌雞胚移植瘤呈紅色，與雞胚絨毛尿囊膜邊界清晰，可見(jiàn)血管長(zhǎng)入移植瘤內(nèi)。瘤組織質(zhì)硬，切面灰紅;光鏡下見(jiàn)移植瘤組織與子宮頸癌組織結(jié)構(gòu)相似，腫瘤細(xì)胞核大小不一、形態(tài)怪異，染色質(zhì)深染，核仁顯著，可見(jiàn)畸形多核細(xì)胞及異常核分裂相(圖1)。

2.4 宮頸癌對(duì)血管生成的誘導(dǎo)作用

接種Hela細(xì)胞組，接種后第1天，接種區(qū)未見(jiàn)新生血管，雞胚原有血管未見(jiàn)致彎曲現(xiàn)象。第2天瘤體周圍有部分宿主血管向其彎曲，靠近。第3天以后瘤體周圍血管逐漸變粗，并可見(jiàn)新生血管向移植瘤呈放射狀集中。第5天新生血管長(zhǎng)入移植瘤內(nèi)，瘤內(nèi)及四周可見(jiàn)大量血管分布(圖2)。對(duì)照組血管分布成樹(shù)枝狀，血管舒展平滑(圖3)。(圖1～3見(jiàn)彩插Ⅲ)。

3 討論

宮頸癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康和生命安全的惡性腫瘤［3，4］，近年來(lái)宮頸癌的治療手段有了改進(jìn)，但其生存率仍然有待提高，宮頸癌的動(dòng)物模型對(duì)提高宮頸癌的實(shí)驗(yàn)研究水平具有重要意義。有人用BALB/c－nude、SCID小鼠或大鼠作為人宮頸癌移植瘤的動(dòng)物模型［5－7］。雞胚作為人類疾病模型有許多優(yōu)點(diǎn)［8］，有人把雞胚作為其它癌細(xì)胞如人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT－29、成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞移植受體［9，10］，或作為腫瘤新生血管形成、腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移潛能，以及抗腫瘤藥物作用機(jī)制探討等方面研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?1］，為建立宮頸癌雞胚模型提供了可能性與借鑒方法。

本實(shí)驗(yàn)首先探明了接種細(xì)胞數(shù)、雞胚胚齡與宮頸癌移植瘤成瘤陽(yáng)性、雞胚存活率率的影響:即雞胚存活率與接種細(xì)胞數(shù)成負(fù)相關(guān)，與接種雞胚日齡呈正相關(guān)。成瘤陽(yáng)性率則與接種細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，當(dāng)接種數(shù)量超過(guò)一定范圍時(shí)，成瘤率反而降低;同樣，雞胚胚齡在7日齡～11日齡時(shí)，成瘤率與胚齡呈正相關(guān)，但超過(guò)11齡時(shí)，成瘤率下降，與其它腫瘤雞胚模型研究所得出的結(jié)論相比，基本變化規(guī)律是一致的，只是具體適宜的接種細(xì)胞數(shù)及接種雞胚日齡卻因腫瘤細(xì)胞不同而不同:如卵巢癌接種細(xì)胞數(shù)低于107不能成瘤［12］，人骨肉瘤接種適宜采用9日齡雞胚，本研究表明制備宮頸癌雞胚模型，接種細(xì)胞個(gè)數(shù)為2.0×106或4.0×106，選擇11日齡雞胚作為受體，可以獲得理想的成瘤陽(yáng)性率。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試采用5日齡、6日齡雞胚接種，但效果不理想，實(shí)驗(yàn)中7日齡、9日齡雞胚組接種，成瘤陽(yáng)性率都不理想，這與制備成釉細(xì)胞瘤、骨肉瘤等其它腫瘤雞胚模型時(shí)所得到的結(jié)論有差距:通常適宜接種的雞胚日齡為7～10 d，但宮頸癌的適宜雞胚日齡達(dá)到11 d，可能表明成瘤率與Hela細(xì)胞自身特性密切相關(guān)。

我們還通過(guò)實(shí)體顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)宮頸癌移植瘤的形態(tài)學(xué)特征以及誘導(dǎo)血管生成情況作了初步探討，觀察到移植瘤組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、切面顏色等特征與人類宮頸癌基本一致，并在接種后觀察到宮頸癌誘導(dǎo)血管生成的過(guò)程及結(jié)果，這為抗Hela細(xì)胞增值及抗血管生成的相關(guān)研究提供了一種新載體，與建立宮頸癌小鼠、大鼠模型相比，建立雞胚宮頸癌模型具有制備方法簡(jiǎn)單、周期短，成本低，符合動(dòng)物福利原則的優(yōu)勢(shì)。而相比于離體細(xì)胞模型，雞胚模型更符合系統(tǒng)論觀點(diǎn)［13］。宮頸癌雞胚模型的建立，為進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲提供了可能。但雞胚系尚未發(fā)育完全的胚胎組織，在結(jié)構(gòu)與代謝功能上，與大、小鼠及人類相比有較大差距，需要引起研究者關(guān)注。

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Establishment and Biological Characteristics of Cervix Cancer Model on Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

TANG Qiu，CUI Shu－fang，CAI LI－ping，JIANG Peng－liang
(Laboratory Animal Centre of the Second Minitary Medical Unniversity，Shanghai 200433，China)

Objective To establish cervix cancer model on the chick embryo chorioallantoic membrane and to study its biological characteristics.Methods Cervix cancer cells were implanted on the chick embryo chorioallantoic membrane.The factors which affect the implanted tumors and the morphological and biological characteristics of the tumors were studied.Result Human cervix cancer model was successfully established.The implanted tumors grew easily on the chick embryo chorioallantoic membrane and had a strong trend of angiogenesis and similar structure as human cancer of the cervix with microscopic verification.Condusion This model is of easy duplication，and could be used in the experiment research for human cancer of the cervix.

Cervix cancer;Chick embryo chorioallantoic membrane;Angiogenesis

Q95－33

A

1671－7856(2010)10－0019－04

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.006

2010－06－21

圖1 人宮宮頸癌雞胚絨毛尿囊膜移植瘤組織形態(tài)（HE染色，x400）
Fig.1 The morhpology of human cervical tumor in chicken chorioallantoic membrane （HE，x400）

圖2 人宮頸癌雞胚絨毛尿囊膜移植瘤誘導(dǎo)血管形成（第5天）
Fig.2 The angiogenesis of human cervical tumor in chicken chorioallantoic membrane （the 5th day）

圖3 接種PBS緩沖液雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)情況（第5天）
Fig.3 The angiogenesis in chicken chorioallantoic membrane inoculated by PBS（the 5th day）

湯球(1971－)，男，碩士，講師，研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。E－mail:tangqiu1999@163.com