雞新城疫病毒抗原制備參數(shù)優(yōu)化相關(guān)性研究

趙英娜 楊平 賈紅梅 陳申秒

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雞新城疫病毒抗原制備參數(shù)優(yōu)化相關(guān)性研究

趙英娜 楊平 賈紅梅 陳申秒

（山東濱州沃華生物工程有限公司 256606）

本試驗(yàn)主要以NDV弱毒株為試驗(yàn)對(duì)象探討了幾種培養(yǎng)因素對(duì)雞胚尿囊液收量和血凝效價(jià)的影響。試驗(yàn)選擇 9、10、11 日齡非免疫雞胚以3個(gè)接種劑量分別接種NDV Lasota株病毒液于雞胚尿囊腔中。結(jié)果表明，選用10日齡雞胚接種劑量為0.1ml／枚時(shí)獲得尿囊液量和血凝效價(jià)為最高。

新城疫病毒 雞胚尿囊液 接種劑量 血凝效價(jià)

新城疫(Newcastle disease, ND)是威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的一種重要傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，OIE將其與高致病性禽流感一起列為危害養(yǎng)禽業(yè)必須報(bào)告的疫病，該病在我國時(shí)有發(fā)生。同時(shí)NDV也是誘導(dǎo)全血產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要誘導(dǎo)劑如NDV誘導(dǎo)生產(chǎn)血源性干擾素[1, 2，3]。近年來，在生產(chǎn)上出現(xiàn)了高致病性的強(qiáng)毒株，甚至超強(qiáng)毒株，一旦發(fā)生，難于控制，往往出現(xiàn)極高的死亡率，給養(yǎng)雞業(yè)帶來毀滅性的打擊。防制本病的有效方法是對(duì)雞群進(jìn)行免疫接種，常用的疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗。隨著毒株毒力的加強(qiáng)，常常要結(jié)合ND油乳劑滅活苗接種才能取得較好的效果而在滅活苗的生產(chǎn)中，目前仍主要采用雞胚作為病毒的繁殖載體。因此，獲得高效價(jià)的病毒液(尿囊液)是制苗的關(guān)鍵。試驗(yàn)對(duì)如何獲得高效價(jià)的尿囊液，確定接種時(shí)種毒的最佳濃度及雞胚尿囊液的最佳收集時(shí)間進(jìn)行探討。通過對(duì)不同日齡的雞胚接種不同劑量的NDV，觀察其對(duì)雞胚尿囊液量及血凝效價(jià)的影響，評(píng)價(jià)最佳種毒接種日齡、接種劑量及其實(shí)用性，旨在為ND油乳劑滅活苗的規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）非免疫雞胚，由濟(jì)南、德州等地種雞場(chǎng)提供；（2）新城疫Lasota病毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；（3）電熱恒溫培養(yǎng)箱SKP—02.600，購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；（4）移液器QY-100ml，購自北京青云卓立精密設(shè)備有限公司；（5）1%雞紅細(xì)胞懸液，0.01mol /L PBS液(pH值7.4)等按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 雞胚的孵化 取非免疫種蛋180枚，隨機(jī)分為9組，每組20枚，放置同一培養(yǎng)箱孵化，孵化溫度37.0℃，相對(duì)濕度51%~55%，每隔2h翻蛋1次。5d頭照檢出無精蛋和死精蛋；9d起每6h照蛋1次，檢出死胚，24h內(nèi)死亡的剔除。

1.2.2 接種 用NDV -Lasota株分別尿囊腔接種9日齡(I組)10日齡(II組)11日齡(Ⅲ組)雞胚，接種劑量分別為：I--1組、II--1組、Ⅲ--1組0.10ml/枚，I--2組、II--2組、Ⅲ--2組0.15ml/枚，I--3組、II--3組、Ⅲ--3組0.20ml/枚。

1.2.3 檢測(cè)方法 接種后96~120h放4℃冰箱過夜，次日收獲。吸出尿囊液置50ml量筒中分別量取每個(gè)雞胚中的尿囊液量。用血液凝集試驗(yàn)(HA)分別測(cè)每組雞胚尿囊液中新城疫病毒的平均效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 尿囊液量與接種劑量的關(guān)系

9、10、11日齡雞胚分別按3個(gè)不同劑量接種NDV后，各組雞胚產(chǎn)生的尿囊液量的差異(見附表)。

附表 雞胚接種不同劑量NDV對(duì)雞胚尿囊液的影響(ml/枚、log2)

項(xiàng)目9日齡10日齡11日齡 I-1I-2I-3II-1II-2II-3III-1III-2III-3 接種劑量0.100.150.200.100.150.200.100.150.20 尿囊液收量13.5413.4413.4313.7313.6313.5913.6713.6413.61 平均HA效價(jià)212212212212212212211211211

由附表可以得出，接種0.1ml/枚的收量顯著高于0.2ml/枚的，而接種0.15ml/枚的和0.2ml/枚的則無顯著差異。從生成的尿囊液量多少來看，接種0.1ml/枚的所得尿囊液量最多，0.15ml/枚的次之，0.2ml/枚的最少。

2.2 尿囊液量與接種日齡的關(guān)系

表1~3表明，不同接種日齡所取得的尿囊液量有顯著差異，在10、11日齡組中，所取得的尿囊液量顯著高于9日齡所取得的尿囊液量，其平均值分別為13.47ml/枚、13.65ml/枚、13.64ml/枚，10、11日齡之間無顯著差異。

2.3 尿囊液血凝效價(jià)與接種劑量、接種日齡的關(guān)系

從試驗(yàn)結(jié)果可知，9日齡與10日齡接種組的平均效價(jià)無明顯差異，但高于11日齡組的HA效價(jià)，尿囊液血凝效價(jià)與接種劑量關(guān)系不大。

3 討論

（1）試驗(yàn)結(jié)果表明，接種劑量對(duì)雞胚尿囊液量有顯著影響，接種劑量增大，則尿囊液量逐漸減少；接種劑量對(duì)雞胚尿囊液的效價(jià)影響不大；接種日齡對(duì)雞胚尿囊液量有顯著影響。（2）NDV接種后的血凝效價(jià)受到很多因素的影響，如雞胚種源差異、孵化技術(shù)﹑培養(yǎng)溫度、接種劑量、接種日齡、種毒稀釋倍數(shù)等，而NDV血凝效價(jià)易受接種病毒量的影響，因此，NDV接種量、培養(yǎng)溫度以及接種胚齡的選擇是獲得NDV高收量和高效價(jià)的關(guān)鍵。本試驗(yàn)結(jié)果表明選擇10日齡接種，接種劑量為0.1ml/枚的Ⅱ-1組為最佳接種組，可獲得多量高效價(jià)的尿囊液。（3）雞胚接種受環(huán)境影響較嚴(yán)重，因此接種操作應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定，采用無菌操作，接種雞胚時(shí)應(yīng)避開胚體和血管，以免影響胚體發(fā)育，使病毒增殖速度減緩或停止，從而減少尿囊液的收集量。（4）不同病毒的增殖有不同的接種途徑，同一種病毒接種不同日齡雞胚所獲得的病毒量也不同。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)不同病毒培養(yǎng)所需要的時(shí)間選擇恰當(dāng)?shù)慕臃N日齡和接種劑量以獲得最高的病毒液量。

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（2015–03–17）

S852.65+9

A

1007-1733(2015)07-0006-02