銀耳菌種規(guī)范化生產(chǎn)工藝講座 (三)
——銀耳兩個純菌種的單獨分離與混合育成母種的技術(shù)

丁湖廣

(福建省古田縣新元食用菌研究所,古田 352200)

銀耳菌種規(guī)范化生產(chǎn)工藝講座 (三)
——銀耳兩個純菌種的單獨分離與混合育成母種的技術(shù)

丁湖廣

(福建省古田縣新元食用菌研究所,古田 352200)

銀耳純白菌絲;香灰菌絲;分離;育種;交合

1 銀耳純菌絲分離操作技術(shù)

單獨分離銀耳純菌絲和香灰菌絲,然后進(jìn)行交合培養(yǎng)的母種,具有適應(yīng)性好、抗逆力強(qiáng)、朵形美、產(chǎn)量高而穩(wěn)的優(yōu)點?？梢岳脙煞N菌絲的不同耐旱力,制定銀耳純菌絲分離方法:將新鮮銀耳分離材料的基質(zhì),通過干燥器逼干,使不耐旱的香灰菌絲先行枯死,進(jìn)而分離獲得耐旱存活的銀耳純菌絲 (圖1)。

1.1 菌材選擇 在室內(nèi)外袋栽或瓶栽銀耳群體中,挑選長勢好、朵形圓正、色白、耳片粗花、肥厚的銀耳。認(rèn)真觀察耳基周圍是否污染霉菌或放線菌等,袋內(nèi)顏色是否均勻,若發(fā)現(xiàn)污染雜菌或出現(xiàn)雜斑的一律去除。一般以出耳后10～13天健壯期的為好。將挑選好的種耳袋 (瓶)經(jīng)表面消毒后,把子實體齊耳基切除;挖出耳基正下方及周圍較硬的基質(zhì)塊,再將基質(zhì)塊切成半個火柴盒大小的方塊,作為分離材料。

1.2 強(qiáng)行逼干 把基質(zhì)塊周圍的木屑培養(yǎng)基刮除,將露出白色菌絲體的基質(zhì)塊用衛(wèi)生紙或紗布包好,置于 “玻璃干燥器”中,干燥器底層置于濃硫酸、五氧化二磷或變色硅膠,以達(dá)到脫水逼干效果。10～15天,香灰菌絲即枯死。也可將基質(zhì)塊用紗布包好,掛在通風(fēng)處,經(jīng)25天左右自然風(fēng)干后,即可進(jìn)行分離。

1.3 定位分離 經(jīng)過干燥的菌材,從不同部位分離的菌絲,其種質(zhì)有別:取淺層菌絲分離的菌種,菌絲容易發(fā)黃,并在試管內(nèi)很快展開耳片,菌株生活力較弱,朵型小,易爛耳;若取深層菌絲分離的菌種,其生理成熟度低,也影響成活率。為了得到生活力旺盛,并適合培養(yǎng)料栽培的菌株,必須取中層以下至深層部位的進(jìn)行分離。該部位分離所得的銀耳菌種,成熟度適中,產(chǎn)量穩(wěn)定。操作時將經(jīng)脫水后的基質(zhì)塊,置于接種箱內(nèi),剝開菌絲,在基質(zhì)塊內(nèi)層,自上而下或從左至右,用接種針挑取具白色菌絲的木屑小顆粒,移接在瓊脂培養(yǎng)基上,一次可接20～30支試管。

圖1 銀耳純菌絲的分離過程

1.4 控溫培養(yǎng) 接種后的試管,置于22～24℃下,經(jīng)8～10天的培養(yǎng),銀耳純白菌絲可以恢復(fù)生長。當(dāng)純白菌絲出現(xiàn)后,用接種針挑取少許移接到瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。若分離培養(yǎng)后還出現(xiàn)香灰菌絲,可繼續(xù)將分離材料干燥,使香灰菌絲全部死亡后再分離。若培養(yǎng)基偏濕或表面存在水滴,培養(yǎng)后則易出現(xiàn)以酵母狀分生孢子方式增殖的現(xiàn)象,或同時出現(xiàn)銀耳純菌絲與酵母狀分生孢子。銀耳純菌絲生長十分緩慢,在適溫下培養(yǎng)20天左右,其菌落只有豆粒大小。

1.5 提純擴(kuò)大 上述第一次分離出來的銀耳純菌絲,待菌落長到黃豆大小時,應(yīng)進(jìn)行純化擴(kuò)大培養(yǎng)。方法是用接種針在銀耳菌落邊緣,挑取小米粒大小帶培養(yǎng)基的銀耳純菌絲,移接到試管培養(yǎng)基斜面上,每管斜面接2～3個點,然后置于23～25℃下培養(yǎng)10天左右。當(dāng)接種點周圍出現(xiàn)白色短密的菌絲,形似繡球狀的白毛團(tuán),而培養(yǎng)基不變色,此即為銀耳純菌種。

2 香灰菌絲分離操作技術(shù)

獲得銀耳純菌絲后,還得分離作為 “開路先鋒”的伴生菌香灰菌絲,其來源與分離技術(shù)如下。

2.1 從種木中分離 在野生銀耳生長的木材中或栽培銀耳的段木中,都存在抗逆性及分解基質(zhì)能力較強(qiáng)的香灰菌絲,經(jīng)過馴化培養(yǎng),其性狀都十分優(yōu)良。袋栽銀耳的培養(yǎng)基內(nèi)的香灰菌絲,常因反復(fù)移植使用,生命力不如前者旺盛。分離香灰菌絲時,應(yīng)選取子實體潔白、朵大、開瓣清楚、無病蟲害、無爛頭和無雜菌的種木,在靠近子實體基部,截取一段作為分離材料。在接種箱內(nèi)割掉子實體,并熏蒸滅菌,然后從木材斷面褐色花紋較密處,切下一小塊木材,用0.1%升汞溶液進(jìn)行表面消毒后,置于培養(yǎng)皿內(nèi)。再用經(jīng)火焰滅菌后的解剖刀,削去木材外層,用刀尖將木材切成粗細(xì)如同火柴梗,長0.5厘米的小段。取一小段接入瓊脂培養(yǎng)基的斜面上,移接后的試管置于24～28℃下,培養(yǎng)5～6天菌絲萌發(fā)。隨著培養(yǎng)時間的延長,菌絲產(chǎn)生色素溶入培養(yǎng)基中,使之變成黑色。當(dāng)菌絲長至斜面1/2時,挑取菌落前端的菌絲,轉(zhuǎn)管純化培養(yǎng)4～5天,便可得到純香灰菌絲體。

2.2 從木屑培養(yǎng)基中分離 在接種箱無菌條件下,打破 (剪開)銀耳菌種瓶 (袋)底部,從大理石狀黑色花紋上選取香灰菌絲生長的前端,挑取米粒大小,移接到瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)2～3天后斜面上的接種點出現(xiàn)灰白色菌絲,繼續(xù)培養(yǎng)1～2天,產(chǎn)生絨毛狀氣生菌絲,并能分泌黑色素使培養(yǎng)基逐漸變?yōu)樽睾谏?。?dāng)菌絲長至斜面1/2時,挑取生長旺盛、爬壁力強(qiáng)的香灰菌絲的前端,轉(zhuǎn)管純化。香灰菌絲生長較快,在24～28℃下培養(yǎng)4～5天,便可獲得純香灰菌絲。

3 兩種菌絲的特征與交合育成母種的方法

銀耳純菌絲和香灰菌絲單獨分離時,由于分離技術(shù)不同,分離效果也不一樣。大致可以得到下列幾種結(jié)果:只得到銀耳純菌絲;只得到羽毛狀香灰菌絲;得到銀耳純菌絲和香灰菌絲;得到酵母狀分生孢子和香灰菌絲。如果有雜菌干擾,情況就更復(fù)雜了。為了得到有生產(chǎn)價值的菌種,在分離的第一周內(nèi),必須每天觀察一次,判斷認(rèn)定銀耳純菌絲或香灰菌絲各已單獨分離出來,然后用于交合母種。

3.1 兩種菌絲的辨別

(1)銀耳純菌絲的特征。白色、淡黃色,以及白至黃的各種中間色。氣生菌絲直立、斜立或平貼于培養(yǎng)基表層,基內(nèi)菌絲生于培養(yǎng)基里面。菌絲直徑1.5～3微米,有橫隔膜,有明顯的鎖狀連合,生長速度比一般食用菌緩慢。在培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)扭結(jié)的菌絲團(tuán),并逐漸膠質(zhì)化,變成小原基,長成小耳片。當(dāng)雙核菌絲開始膠質(zhì)化,是菌絲進(jìn)入結(jié)實階段的標(biāo)志。雙核菌絲移植后,受菌齡、發(fā)育程度、培養(yǎng)基表面的游離水和機(jī)械刺激等的影響,或繼續(xù)長菌絲,或迅速膠質(zhì)化,或變成酵母狀分生孢子。

(2)香灰菌絲的特征。初期白色,常有特別細(xì)長的主干和側(cè)生的、略呈羽毛狀的分枝,老菌逐漸變成淺黃、淺棕色,培養(yǎng)基逐漸由淡褐色變?yōu)楹谏蚰G色。培養(yǎng)基表面的氣生菌絲呈灰白色、細(xì)絨狀,有時有碳質(zhì)的黑疤。分生孢子梗呈掃帚狀,較少見,產(chǎn)生時為黃綠色至草綠色,近橢圓形,直徑3～5微米,在段木表面還可形成扁平黑色的子座。已知羽毛狀香灰菌絲絕不單是1個種,可能有2個屬3～4個種。

3.2 兩種菌絲交合育成母種的方法 經(jīng)純種分離法而得到單一的銀耳純菌絲或香灰菌絲,如果單獨接種在棉籽殼或木屑等培養(yǎng)基上培養(yǎng),是無法形成銀耳子實體的。在生產(chǎn)上必須將兩者混合培養(yǎng)才能形成高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的銀耳子實體。因此,人工培育的銀耳菌種,必須是銀耳純菌絲與香灰菌絲的混合體。兩種菌絲交合培養(yǎng)成母種,一般需要30天左右。具體交合的方法有兩種。

(1)在瓊脂培養(yǎng)基上交合。用芽孢進(jìn)行混合培養(yǎng)的,應(yīng)先接種少許芽孢,待其萌發(fā)形成銀耳菌絲后,再接種香灰菌絲。如果是用銀耳純菌絲進(jìn)行混合培養(yǎng),應(yīng)將一塊帶瓊脂培養(yǎng)基似米粒大的銀耳純菌絲,移到另1支瓊脂斜面上,置22～24℃下培養(yǎng)5～7天。待銀耳菌落直徑達(dá)1厘米以上時,在其旁邊接入一小點帶瓊脂培養(yǎng)基的香灰菌絲,在相同溫度下繼續(xù)培養(yǎng)7天左右,出現(xiàn)繡球狀白毛團(tuán);10天后在白毛團(tuán)上方出現(xiàn)無色或淡黃色水珠。香灰菌絲快速生長布滿整個培養(yǎng)基,并分泌黑色素,使瓊脂培養(yǎng)基底部呈黑色。這種混合菌絲體的銀耳母種,1支試管一般只接1瓶原種。

(2)在木屑培養(yǎng)基上交合。先將帶瓊脂培養(yǎng)基的花生米大小的銀耳純菌絲團(tuán)接入木屑培養(yǎng)基中央;再用接種針挑取香灰菌絲連同培養(yǎng)基,以小米粒大小移接在菌種瓶的木屑培養(yǎng)基上,兩種菌絲塊緊靠一起。然后置于22～24℃,空氣相對濕度70%以下條件下培養(yǎng)15天左右。待香灰菌絲長至培養(yǎng)基3～4厘米深,瓶壁上可見黑色花紋;白毛團(tuán)分泌淡黃色或淺褐色水珠時,繼續(xù)培養(yǎng)5天,白毛團(tuán)膠質(zhì)化,出現(xiàn)淡黃色原基,并逐漸長出拇指大小的子實體時,即成木屑培養(yǎng)基母種。

4 銀耳 “非專一性”分離擇優(yōu)交合的育種方法

長期以來,我國銀耳菌種分離方法強(qiáng)調(diào) “專一性”,即銀耳菌絲和香灰菌絲分離時必須在同一耳木或同一袋木屑培養(yǎng)基上,分別獲得銀耳純菌絲 (包括酵母狀分生孢子)和香灰菌絲進(jìn)行交合。而不同地區(qū)或同一地區(qū),不同耳木或不同木屑培養(yǎng)基獲得的兩種菌絲,不能隨意調(diào)換,否則就可能導(dǎo)致失敗。

自1993年開始,古田縣興達(dá)銀耳研究所張漢文所長,開展在不同栽培地點、不同菌株、不同木屑培養(yǎng)基內(nèi),分離出銀耳菌絲與香灰菌絲,經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行擇優(yōu)調(diào)換,互相錯開交合的育種試驗。結(jié)果表明:“非專一性”的擇優(yōu)交合,從母種、原種、栽培種,直至用于袋栽生產(chǎn),它與“專一性”對照組相比,菌絲生長狀況與出耳時間、品質(zhì)及產(chǎn)量都較優(yōu)。這說明銀耳菌種分離材料,也可以從異地引進(jìn)野生或段木的香灰菌絲與當(dāng)?shù)啬拘即糟y耳純菌絲交合,關(guān)鍵在于選取分離材料時擇優(yōu)母體。優(yōu)中交合,使菌種不斷優(yōu)化,才能為銀耳制種拓寬途徑。該所每年都從四川通江等段木栽培地,引進(jìn)長過銀耳的木段,分離香灰菌絲,再與古田袋栽銀耳純菌絲交合,獲得理想菌株。以此種 “非專一性”交合育種方法,完成了寧德市科技局 《征集野生銀耳種源選育優(yōu)良菌株研究》項目,選育出抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高的2個新菌株,其出耳現(xiàn)場,獲得驗收組專家好評。

“非專一性”的分離交合,長期被視為難題的原因,主要是當(dāng)時研究銀耳菌種的單位和專業(yè)人員不多,發(fā)現(xiàn)銀耳兩種菌絲的歷史不長,純菌絲親和能力較弱,適應(yīng)性不強(qiáng),稍有不周,分離便告失敗。所以,這種 “非專一性”的問題一直未被解決。隨著銀耳人工馴化栽培方式的演變,由段木→木屑瓶內(nèi)開花→木屑瓶外展片→室內(nèi)袋料栽培→野外蔭棚栽培;由小面積發(fā)展到千家萬戶專業(yè)化、商品化、基地化的大規(guī)模栽培。這種演變過程,使銀耳菌絲的適應(yīng)性不斷增強(qiáng),“非專一性”交合,在生理上逐步適應(yīng),這為 “不同一”擇優(yōu)交合育種提供了內(nèi)因條件,這是生物進(jìn)化的自然規(guī)律。但從不同野生耳木或不同產(chǎn)地采集分離獲得的香灰菌絲,接種在同一培養(yǎng)基上,又會出現(xiàn)不親和的拮抗線,說明香灰菌品系之間有特殊個性。對此,還有待進(jìn)一步探討(圖 2)。

圖2 不同香灰菌絲接種在同一培養(yǎng)基上產(chǎn)生的拮抗線

5 母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)接方法

一般對分離獲得的一代母種,都要進(jìn)行擴(kuò)大繁殖,即選擇菌絲粗壯、生長旺盛、顏色純正、無雜菌的試管母種,或從科研部門引進(jìn)母種,進(jìn)行轉(zhuǎn)管擴(kuò)大繁殖,增加母種數(shù)量,以滿足生產(chǎn)需要。銀耳混合菌絲的試管母種,每支一般只能擴(kuò)接成2～4支。轉(zhuǎn)管次數(shù)不應(yīng)過多,否則菌種長期處于營養(yǎng)生理狀態(tài),生命繁衍受到抑制,進(jìn)而導(dǎo)致菌絲活力下降,營養(yǎng)生長期縮短,子實體變小,變薄,影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)接,一般宜為3次。

母種轉(zhuǎn)管擴(kuò)接無菌操作技術(shù)如下。

5.1 消毒握管 雙手和菌種試管外壁,用75%酒精棉球擦拭;將菌種和斜面培養(yǎng)基的2支試管握在左手中,使中指位于2試管之間,斜面向上,并使其呈水平位置。

5.2 松塞灼口 用右手將棉塞擰轉(zhuǎn)松動,以利接種時拔出;右手拿接種針,對在接種時可能進(jìn)入試管的部分,全部用火灼燒過;再用右手小拇指、無名指和手掌拔掉棉塞,夾住。靠手腕的動作不斷轉(zhuǎn)動試管口,并通過火焰灼燒。

5.3 接種入管 將燒過的接種針伸入試管內(nèi),先接觸沒有長菌絲的培養(yǎng)基,使其冷卻;然后將接種針輕輕接觸菌種挑取少許,抽出試管,注意菌種塊不能碰到管壁;隨之將接種針上的菌種,迅速通過酒精燈火焰上方,伸進(jìn)另一支試管,接入培養(yǎng)基中央。

5.4 回塞管口 菌種接入后,灼燒管口,并在火焰上方將棉塞塞好。塞棉塞時不要用試管去迎棉塞,以免試管在移動時進(jìn)入不凈空氣。

接種的整個過程應(yīng)迅速、準(zhǔn)確。最后將接好的試管貼上標(biāo)簽,送進(jìn)培養(yǎng)箱 (室)培養(yǎng)。