馬牧欣 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)四科 150001

成肌細(xì)胞移植改善心肌梗死大鼠心功能的機(jī)制

馬牧欣 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)四科 150001

目的：研究心肌梗死大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞移植后心功能變化情況，同時(shí)觀察移植后的成肌細(xì)胞的存活及P2X1受體的表達(dá)情況。探討骨骼肌成肌細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死后心功能的改善作用的機(jī)制。方法：以同種系Wister大鼠為研究對(duì)象，取其股四頭肌肌組織，采用膠原酶、鏈酶蛋白酶兩步消化法獲取大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。取同種系Wister大鼠30只隨機(jī)分為2組（對(duì)照組和移植組）采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的方法制造心梗模型，模型建立一周后再次開胸分別以分點(diǎn)注射法于心臟梗死區(qū)輸入細(xì)胞培養(yǎng)液（對(duì)照組）或成肌細(xì)胞懸液（移植組）。于建模前、成肌細(xì)胞移植術(shù)前及移植術(shù)后第一、二周行超聲心動(dòng)檢測。處死動(dòng)物后，進(jìn)行普通HE染色，抗myosin、抗P2X1受體免疫組化染色。結(jié)果：超聲顯示骨骼肌成肌細(xì)胞移植后二周，大鼠心臟功能較移植前有明顯改善，其中射血分?jǐn)?shù)由（40.3±2.5）%增加到（52.1± 2.3）%且與對(duì)照組相比有顯著差異（P﹤0.05）。普通HE染色發(fā)現(xiàn)，移植組的心梗區(qū)域可見紅色的條索狀團(tuán)塊?？筸yosin染色證實(shí)有移植的細(xì)胞存在。抗P2X1受體染色陽性。結(jié)論：骨骼肌成肌細(xì)胞移植后能在大鼠體內(nèi)存活，移植二周后對(duì)心肌梗死后心功能降低即有明顯的改善作用，這可能與P2X1受體對(duì)細(xì)胞間連接的調(diào)節(jié)及其介導(dǎo)的正性肌力作用有關(guān)。

骨骼肌成肌細(xì)胞；心肌梗死；細(xì)胞移植；P2X1受體；縫隙連接

骨骼肌成肌細(xì)胞（skeletal myoblast）是一種位于肌纖維的肌膜與基底膜之間的組織干細(xì)胞，在適當(dāng)條件下可分化成有收縮能力的肌細(xì)胞。自上個(gè)世紀(jì)九十年代起，科學(xué)家們就開始了成肌細(xì)胞移植治療心肌梗死的研究，證實(shí)處于心臟微環(huán)境中的成肌細(xì)胞趨向于向心肌細(xì)胞分化，減緩心梗后心臟射血分?jǐn)?shù)的降低，增強(qiáng)疤痕區(qū)的收縮功能。Dowell[1]等進(jìn)一步的研究也證明盡管缺乏成肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞間形成有效連接的證據(jù)，但移植對(duì)左心收縮功能的改善是明顯而持續(xù)的，且與移植細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。那么，移植的骨骼肌成肌細(xì)胞到底是通過什么機(jī)制改善心功能的，它和心肌細(xì)胞間究竟能否形成有效的電生理連接，二者之間的矛盾使電機(jī)械偶聯(lián)的研究又成為近來的熱點(diǎn)，其中以心室肌細(xì)胞縫隙連接的主要連接蛋白43（connexin 43）的研究居多。

心肌細(xì)胞之間的縫隙連接傳導(dǎo)可通過ATP與connexin之間的特異性配體-受體相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。近來有報(bào)道P2X1受體（ATP受體的亞型之一）與Cx43密切相關(guān)[2]。本試驗(yàn)主要研究成肌細(xì)胞移植入大鼠心肌梗死區(qū)后心功能的改善情況及是否有P2X1受體的表達(dá)，初步探討P2X1受體在成肌細(xì)胞移植改善心梗后左心功能中的可能機(jī)制。

一、材料與方法

1 大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的提取、純化、培養(yǎng)及鑒定

選用成年Wistar大鼠，體重150～180g雌雄不限，無菌條件下切取股四頭肌1g，PBS沖洗后剔除脂肪組織，剪成1～2mm3的小塊后PBS漂洗2次，37℃水浴搖床中酶解30～50min(膠原酶IA，1.0mg／ml)，加PBS終止消化，漂洗2次，1000r/min離心5min，棄上清，繼之加入1%鏈酶蛋白酶于37℃水浴箱中消化20～30min，加培養(yǎng)液終止消化，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，1000r/min，5min離心，棄上清后加2ml細(xì)胞增殖培養(yǎng)液（含20% FBS的Ham’s F10）制成細(xì)胞懸液，緩緩加入含20%/60%percoll的10ml離心管中，800r/min離心15分鐘。吸取中層液面入10ml離心管中，PBS漂洗3次，沉淀用4ml增殖培養(yǎng)液重懸，吸入T25塑料培養(yǎng)瓶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5%CO2)。接種密度為1～3×105/ml。

2 大鼠心梗模型的建立

取成年wistar大鼠，體重200～230g，雌雄不限，隨機(jī)分為2組（實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組），每組15只。10%水合氯醛麻醉（3ml/ kg，ip）后，16G靜脈留置針直視下氣管插管，確認(rèn)進(jìn)入氣管后，右側(cè)臥位，接呼吸機(jī)（參數(shù)：volum模式，呼吸頻率50/ min，潮氣量10cc/kg）。于心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處，多為第4肋間開胸，暴露心臟后用開胸器撐開肋骨良好顯露術(shù)野。用5/0帶線縫合針在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間平左心耳下緣迅速縫扎左前降支近端，結(jié)扎即刻見左室前降支供血區(qū)域變白即為結(jié)扎確切。膨肺后關(guān)胸，縫合皮膚。縫合前傷口局部撒硫酸慶大霉素預(yù)防感染。手術(shù)后大鼠約30min完全清醒。

3 骨骼肌成肌細(xì)胞及培養(yǎng)液的回輸

第二代成肌細(xì)胞生長至80%～90%密度時(shí)，用0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，并進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞占95%以上。Ham’s F10漂洗3次以洗去殘余血清。用Ham’s F10制成濃度為2～3×107/ ml的細(xì)胞懸液，放入冰盒內(nèi)以備移植用。心梗1周后的大鼠，10%水合氯醛麻醉（3ml/kg，ip）后，16G靜脈留置針直視下氣管插管，確認(rèn)進(jìn)入氣管后，仰臥位，接呼吸機(jī)（參數(shù)：volum模式，呼吸頻率50/min，潮氣量10cc/ kg）。取左側(cè)胸骨旁縱切口，剪斷第2～4肋骨后，剪開胸膜，暴露心臟后用開胸器撐開切口良好顯露術(shù)野。眼科鑷小心剝離心臟與周圍胸壁粘聯(lián)組織，暴露心肌梗死區(qū)，可見梗死區(qū)心肌變白，表面有纖維素附著。吸管吹勻離心管中的細(xì)胞懸液，用1mlBD針吸取100微升細(xì)胞懸液，分5點(diǎn)斜刺入梗死區(qū)，每點(diǎn)注入25微升細(xì)胞懸液，觀察5min后，膨肺關(guān)胸，縫合皮膚?？p合前傷口局部撒硫酸慶大霉素預(yù)防感染。手術(shù)后大鼠約40min后完全清醒。

4 記錄數(shù)據(jù)

4.1 超聲心動(dòng)檢測

以超聲心動(dòng)儀（HP）檢測大鼠心功能。所有指標(biāo)均取五個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。試驗(yàn)鼠的心率、心室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率的測定以鑒定心臟功能狀況，并將各組測量值進(jìn)行比較。用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即 ±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P﹤0.05作為差異有顯著意義。

4.2 病理檢測

取原代細(xì)胞及3代細(xì)胞消化后進(jìn)行細(xì)胞爬片，待長至80%～90%密度時(shí)用4%多聚甲醛固定，以備免疫組化檢測成肌細(xì)胞特異性抗體myosin及desmin之用。

大鼠心梗兩周，采集數(shù)據(jù)后，將試驗(yàn)大鼠處死，心肌組織送檢病理，進(jìn)行常規(guī)HE染色，抗myosin、抗P2X1受體免疫組化染色。

二、結(jié)果

1 大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)

分離的原代骨骼肌成肌細(xì)胞成球形，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)2小時(shí)后細(xì)胞開始貼壁，24小時(shí)后貼壁完全，細(xì)胞逐漸延展成梭形或紡錘形（圖1），隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個(gè)方向平行排列。當(dāng)細(xì)胞融合到80%以上后，不需分化培養(yǎng)基即可自發(fā)性地相互融合，形成肌管（圖2）。為避免成肌細(xì)胞融合形成肌管，待細(xì)胞長成80 %密度時(shí)即進(jìn)行傳代。傳代細(xì)胞30min即開始貼壁，12小時(shí)貼壁完全，增值速度較原代細(xì)胞明顯加快，平均7天傳代一次。免疫組織化學(xué)染色顯示desmin及myosin在成肌細(xì)胞及肌管中均為陽性（圖3、4，未著色的為混雜的成纖維細(xì)胞）。

2 大鼠心梗模型的建立及細(xì)胞回輸

共2只大鼠死亡，均為實(shí)驗(yàn)組大鼠，死亡率6.6%。死亡原因，一只為術(shù)中出現(xiàn)室顫，另一只為二次開胸時(shí)組織粘連，胸腔出血。結(jié)扎前降支后，肉眼可見結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌顏色變淺，主要局限在左心室，靠近心尖部較為明顯（圖5）。正常和缺血交界處充血，顏色發(fā)紺。心梗1周后二次開胸，可見梗死區(qū)心肌變白，表面有纖維素附著（圖6）。進(jìn)一步證實(shí)大鼠心肌梗死模型建立成功。

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3 心功能測定

超聲心動(dòng)檢測心率、射血分?jǐn)?shù)短軸縮短率等各指標(biāo)顯示，心梗建立前各組各檢測指標(biāo)間無明顯差異；心梗建立后1周，細(xì)胞及培養(yǎng)液移植前各檢測指標(biāo)較組內(nèi)心梗前有明顯差異，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反映心臟收縮功能的EF%和FS%于移植后2周明顯增高，且移植細(xì)胞組明顯高于移植后1周檢測值和對(duì)照組檢測值；對(duì)照組在移植后不同時(shí)間點(diǎn)測量值無顯著性差異（表1）。

4 HE染色及免疫組化

正常心肌組織心肌纖維排列均勻整齊，橫紋清楚，細(xì)胞大小均勻一致，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻（圖7）。心梗模型建立后1周，心肌組織切片HE染色可見肌細(xì)胞明顯腫脹，灶性壞死區(qū)核溶解，炎細(xì)胞浸潤（圖8）。移植組術(shù)后2周心肌內(nèi)可見細(xì)胞核相對(duì)較大，紅色條索狀的成團(tuán)細(xì)胞，周圍有炎細(xì)胞浸潤（圖10）；而對(duì)照組未見成肌細(xì)胞（圖9）。免疫組化顯示，在移植部位有成肌細(xì)胞特異性抗體myosin染色陽性的細(xì)胞（圖11，深棕色，胞漿）；胞膜可見P2X1受體染色陽性（圖12，深棕色，胞膜）。

三、討論

骨骼肌成肌細(xì)胞是源于胚胎中胚層的干細(xì)胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜與肌纖維漿膜之間，處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)受到外界刺激,在應(yīng)激狀態(tài)下可以分裂、增生，形成新的肌纖維，是骨骼肌再生的儲(chǔ)備力量。作為成體干細(xì)胞的一種，它具有橫向分化的潛能，多項(xiàng)動(dòng)物及臨床試驗(yàn)表明[3-5]，骨骼肌成肌細(xì)胞移植入心肌梗死區(qū)可以存活并改善心梗后心功能。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膠原酶及鏈酶蛋白酶兩部消化法成功培養(yǎng)出成肌細(xì)胞，percoll的應(yīng)用能夠有效的去除部分成纖維細(xì)胞及肌碎片，加快原代細(xì)胞貼壁時(shí)間。細(xì)胞生長曲線顯示第6天即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，增值明顯加快。細(xì)胞爬片進(jìn)行desmin及myosin（肌生成素）染色均為陽性。

細(xì)胞的移植時(shí)間選擇在心肌梗死模型建立后的第7天，主要依據(jù)是[6]，心肌梗死后的5天內(nèi)是炎癥反應(yīng)期，且最初24小時(shí)最為強(qiáng)烈，在此期間植入將導(dǎo)致細(xì)胞參與到炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，將影響有效的肌細(xì)胞和血管的生成。而心肌梗死后7天時(shí)，血管內(nèi)皮生長因子的濃度能達(dá)最高峰，心肌梗死2周，瘢痕組織已經(jīng)開始形成。因此，細(xì)胞移植的理想時(shí)間點(diǎn)是心肌梗死發(fā)生后的7天至14天之間。

對(duì)心肌梗死大鼠實(shí)行骨骼肌成肌細(xì)胞移植后心功能的檢測，通過與對(duì)照組（培養(yǎng)液移植組）相對(duì)比發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞移植能對(duì)心肌梗死大鼠的心功能起到明顯的改善作用。超聲心動(dòng)檢測心率、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率等各指標(biāo)顯示，心肌梗死建立前，各組各檢測指標(biāo)間無明顯差異；心肌梗死建立后1周，與梗死前比較，兩組心功能均降低，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反映心臟收縮功能的EF %和FS%，于移植后2周明顯升高，且明顯高于對(duì)照組和移植后1周檢測值；對(duì)照組在移植后不同時(shí)間點(diǎn)測量值無顯著性差異。說明骨骼肌成肌細(xì)胞移植有助于心肌梗死大鼠心臟收縮功能的改善。

雖然骨骼肌成肌細(xì)胞始終不能轉(zhuǎn)化成心肌細(xì)胞[7]，但以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8-10]表明骨骼肌成肌細(xì)胞在移植入心梗部位后可以成為可成活的肌肉組織，并能改善受損心臟的收縮功能，并且某些表型將變得能與心肌細(xì)胞相似，認(rèn)為雖然移植的成肌細(xì)胞不是形成了心肌細(xì)胞，但是可分化成能負(fù)擔(dān)心臟工作的慢收縮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)選擇的myosin抗體是MY-32克隆，可與骨骼肌肌凝蛋白重鏈（myosin heavy chain）反應(yīng)，但不與平滑肌或心肌的肌凝蛋白反應(yīng)。第3代成肌細(xì)胞爬片的myosin染色陽性，移植后2周的心梗大鼠心肌梗死區(qū)域亦可見myosin陽性染色的細(xì)胞，形成條索狀纖維，而在對(duì)照組未見類似細(xì)胞生長，myosin染色亦陰性。這表明移植2周后，成肌細(xì)胞可在心肌梗死區(qū)域存活。

1972年Burnstock首次提出“嘌呤受體”的概念，描述細(xì)胞膜腺苷受體和ATP受體。對(duì)胞外腺苷敏感的受體稱Pl，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族；胞外核苷酸的受體稱為P2，包括P2X和P2Y兩類，其中P2Y屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，P2X則是配體ATP門控的離子通道，當(dāng)胞外ATP結(jié)合時(shí)P2X通道打開，允許陽離子通過。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，有5個(gè)P2Y（P2Yl，P2Y2，P2Y4，P2Y6，P2Y11）和7個(gè)P2X（P2Xl～7）受體已被克隆并闡明其藥理學(xué)特性。

在心肌中，臨近的心肌細(xì)胞是通過閏盤相連接的，閏盤是細(xì)胞膜的一個(gè)特殊部位，包括縫隙連接、膜表面黏附分子及橋粒。而其中的縫隙連接是一種離子通道，細(xì)胞與細(xì)胞之間動(dòng)作電位的快速傳導(dǎo)和化學(xué)信號(hào)的直接傳遞就是通過縫隙連接實(shí)現(xiàn)的。哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞的縫隙連接主要是connexin43，因此connexin43成為研究移植的骨骼肌成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間電-機(jī)械偶聯(lián)的重要目標(biāo)。近來的研究[11]發(fā)現(xiàn)在體外共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞與骨骼肌成肌細(xì)胞可形成同步搏動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)，甚至在免疫熒光染色后在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)了二者之間可能存在由N-cadherin和Connexin43介導(dǎo)的連接。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12]也發(fā)現(xiàn)來自于宿主心肌細(xì)胞的電活動(dòng)可能也能引起骨骼肌細(xì)胞的收縮，但該研究者認(rèn)為電活動(dòng)是通過細(xì)胞膜直接接觸傳導(dǎo)的，而不是通過有效連接快速傳導(dǎo)的。骨骼肌成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞間存在電-生理偶聯(lián)始終沒有直接證據(jù)。Lele Jiang 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在人的左心室中，P2X1受體的表達(dá)與connexin43密切相關(guān)，部分P2X1受體與connexin43一樣都在閏盤中表達(dá)，主要集中于閏盤的中部。在閏盤表達(dá)的P2X1受體的功能目前還不十分清楚。早在1990年，Sugiura等[13]即發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞中，ATP可通過與特異性的受體結(jié)合調(diào)節(jié)縫隙連接通道蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)縫隙連接的選擇通透性。以往對(duì)其它細(xì)胞的研究亦表明[14-17]，ATP可通過調(diào)節(jié)connexin43的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)縫隙連接選擇通透性的形成，而且它可能是一種促進(jìn)細(xì)胞與臨近細(xì)胞形成縫隙連接的信號(hào)分子。而ATP為P2X1受體的配體，ATP、P2X1受體以及connexin43之間是通過什么通路進(jìn)行相互作用和調(diào)節(jié)的目前尚不十分清楚，還有待遇進(jìn)一步的研究。

P2X1受體表達(dá)的另外一項(xiàng)作用可能為其介導(dǎo)的正性肌力作用。當(dāng)任何一種亞型的P2X受體與胞外ATP結(jié)合時(shí)，P2X通道打開，允許陽離子通過，如鈉、鉀、鈣離子等(但以鈣離子的通透性為著)，從而引起膜電位改變，L型Ca2＋通道開放，Ca2＋內(nèi)流促使肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣池釋放更多的Ca離子，胞內(nèi)鈣增多，繼而引起細(xì)胞收縮力增強(qiáng)[18-19]。免疫組化顯示P2X1受體在血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)，在大鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但充血性心力衰竭大鼠左心室的P2X1受體mRNA水平增加了2.7倍[20]?？赡芘c缺氧的心肌細(xì)胞能夠釋放ATP[21]，使P2X1受體表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮P2受體介導(dǎo)的正性肌力作用[22]有關(guān)。心肌梗死區(qū)域中存活的成肌細(xì)胞所表達(dá)的P2X1受體可能會(huì)發(fā)揮其正性肌力作用，加強(qiáng)心肌梗死區(qū)的收縮力，從而改善整體的心功能。

總之，在成功移植了成肌細(xì)胞并改善心梗大鼠心功能的基礎(chǔ)上，P2X1受體表達(dá)陽性，推測與P2X1受體在改善心功能方面的作用主要有以下兩點(diǎn)：1）P2X1受體與縫隙連接蛋白connexin43之間關(guān)系密切，可調(diào)節(jié)connexin43的表達(dá)和電信號(hào)或化學(xué)信號(hào)的傳遞，進(jìn)而完善成肌細(xì)胞之間及成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間的同步收縮；2）P2X1受體可通過特異性配體ATP的結(jié)合而發(fā)揮正性肌力作用，從而加強(qiáng)心肌梗死區(qū)的收縮力。

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10.3969/j.issn.1001-8972.2010.21.101

馬牧欣,心內(nèi)科碩士，醫(yī)師。

AbstractObjective: Evaluate the effect of rat skeletal myoblast transplantation on heart function of myocardial infraction, the survival in infracted myocardium, and the expression of P2X1 receptors in grafted myoblast.Methods: Thirty male Wister rats were divided at random into transplantation group(n=15) and control group(n=15).Acute myocardial infraction was induced by ligation of left anterior descending coronary artery.Myoblast was draw from tibial muscle of rats, cultured.Myoblast was injected into the infracted region of transplantation group, culture medium was injected into the infracted region of control group at 1 week after infraction.Cardiac function was evaluated before MI, 1 week after MI, 1 and 2 weeks after cell delivery.2 weeks after MI, HE, antimyosin and anti-P2X1 receptors staining were performed.Result: Compared with control group, left ventricular ejection function (LVEF) and fractional shortening (FS) were improved significantly 2 weeks after transplantation.At the infracted region of transplantation group, myosin-positive cells were found, and were positively stained by P2X1 receptors staining.Conclusion: Transepicardial delivery of skeletal myoblast can significantly improve cardiac function and survive at the infracted region.The mechanism of the improvement of cardiac function maybe related with the presence of P2X1 receptors at the infracted region, which suggests their role in the restoration of gap junction between cardiomyocyte and the inotropic effect mediated by P2X1 receptors.

Key wordsskeletal myoblast；myocardial infraction；cell transplantation；P2X1 receptors gap junction