李志才,易康樂

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南 長沙 410131)

大理石花紋是指肌肉內(nèi)脂肪數(shù)量和分布,與嫩度、多汁性和適口性有密切的關(guān)系[1]。我國2003年發(fā)布的《牛肉質(zhì)量分級》行業(yè)標準中牛肉質(zhì)量等級評定主要借鑒美國、日本的評定體系,以12～13脊肋處背最長肌橫截面的大理石紋和牛的生理成熟度為主要評定指標牛肉。大理石花紋的豐富程度受多基因控制以及營養(yǎng)環(huán)境等因素影響[2,3]。

在美國、愛爾蘭、西班牙、瑞典、英國等國大理石花紋是牛肉“貨架質(zhì)量”顯著有用的指標。H-FABP是脂肪酸結(jié)合蛋白基因,主要在心臟和骨骼肌細胞、乳腺細胞表達,對肌間脂肪含量影響顯著[2]。CAST是鈣蛋白酶抑制蛋白,直接影響肌原纖維蛋白的代謝以及肌肉的嫩化[4]。MYOD1是生肌決定因子1基因,在肌肉生成過程中參與分子調(diào)節(jié)控制作用。MYOD1家族對生肌發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用,可激活靜止狀態(tài)的肌肉特有基因與肌肉特有的增強子結(jié)合共同促進轉(zhuǎn)錄,可促使成纖維細胞、成軟骨細胞、平滑肌細胞等向骨骼肌細胞分化,對于家畜的肌肉生長有重要影響[5]。10%左右的肌內(nèi)脂肪含量(intramuscular fat content,IMF)可產(chǎn)生理想的大理石花紋,從而形成優(yōu)質(zhì)高檔牛肉[6]。因此可以利用對IMF含量進行遺傳改良,以提高牛肉品質(zhì)。

本實驗旨在通過分析H-FABP基因5′端調(diào)控區(qū)的多態(tài)性和湘西黃牛肉肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋豐富程度的相關(guān)性,利用最小二乘線性模型分析不同基因型與肉質(zhì)性狀中的肌內(nèi)脂肪含量值和大理石花紋等級評分的關(guān)系,為湖南省地方品種-湘西黃牛的肉品質(zhì)育種改良提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

23頭實驗牛來自湖南新晃縣畜牧水產(chǎn)局肉牛育肥中心。屠宰時收集每一頭牛的血樣,每頭 10 mL,共采集24份血樣。血樣用ACD抗凝,留做后續(xù)實驗用。選取胴體第12～13肋骨間的眼肌橫切面中背長肌為有效部位,以供大理石花紋等級和肌內(nèi)脂肪含量評定。

1.2 實驗方法

1.2.1 大理石花紋等級評定 以南京農(nóng)業(yè)大學肉類研究室大理石花紋標準,采用人工肉眼判別大理石花紋等級。肌內(nèi)脂肪含量由湖南農(nóng)業(yè)大學食品檢測中心測定。

1.2.2 脂肪測定方法 參照GB/T5009.6-2003標準進行。

1.2.3 血樣基因組DNA的提取 采用上海捷瑞生物科技公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒進行。得到的基因組DNA采用核酸蛋白測定儀測定其濃度,并用1%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的牛H-FABP基因序列擴增 H-FABP5′端調(diào)控區(qū),長度為250 bp左右,設(shè)計引物如下:5'-TCT GTC GTC TT T CCC AAC CTA-3';5'-GGC TCC CCA ACC TTG AC-3'。

1.2.5 目的片段擴增 PCR擴增體系為 10×Buffer(Mg2+plus)2.0 μ L,20 μ mol/L 引 物 0.2 μ L,2.5 μ mol/L dNTPS1.6 μ L,5 U/μ LTaq 酶 0.4 μ L,模板 DNA 為 50 ng/L 的 1 μ L,加水至 20 μ L 。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,58℃退火30 s,72℃延伸 40 s,72℃再延伸 8 min,共30個循環(huán)。

1.2.6 PCR-SSCP檢測 本實驗采用8%的丙烯酰胺膠,制膠,灌膠,點樣,于室溫下電泳(溫度在8℃左右)2.5～3 h。電泳結(jié)束后用硝酸銀染色,顯色后,用去離子水漂洗2次,在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.2.7 純合子序列測定 本實驗選用PCR產(chǎn)物進行序列測定。選取特異性好的PCR擴增產(chǎn)物,利用百泰克回收試劑盒對其進行回收與純化,純化回收后送上海生工測定序列。測序結(jié)果經(jīng)與NCBI登錄號為DQ026674的序列進行比較,發(fā)現(xiàn)該群體中HFABP基因5′-調(diào)控區(qū)第136位發(fā)生了T堿基的插入,142位點發(fā)生了G※A轉(zhuǎn)換。AA基因型為A142A純合子,BB基因型為G142G純合子。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.3.1 基因和基因型頻率分析 基因型頻率是指決定該性狀的基因座上的兩個等位基因或多個復(fù)等位基因所組成的各種基因型的個體分別在群體中所占的比率:基因頻率是指同一基因座上兩個等位基因或多個復(fù)等位基因分別在群體內(nèi)該基因座上的基因總數(shù)中所占的比率。各基因的頻率之和等于1。

其中,Pi:第i個等位基因的頻率;i:純合復(fù)等位基因;j1,j2,……,jn:與i共顯的第1到第n個等位基因。

1.3.2 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析H-FABP基因的遺傳多態(tài)性與大理石花紋和肌內(nèi)脂肪相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 全血基因組DNA提取結(jié)果

圖1 牛全血基因組DNA

圖2 H-FABP基因PCR產(chǎn)物

圖1中,左端為1 kb marker,右端為全血基因組DNA,從圖中可以看出DNA條帶清晰明亮,無拖尾現(xiàn)象,可以進行下一步實驗。

2.2 目的片段擴增結(jié)果

圖2所示,右端為100 bp DNAmarker,左端為PCR擴增產(chǎn)物,由圖可見擴增產(chǎn)物長度為250 bp,與所預(yù)計的片段大小一致,且無非特異條帶,可以進行下一步實驗。

2.3 PCR-SSCP檢測結(jié)果

從圖3的結(jié)果中可以看出,本研究的樣本中H-FABP基因存在2個等位基因(A、B),3個基因型AA(2)、BB(3,4)、AB(1,5,6)。實驗用牛肉大理石紋等級、肌內(nèi)脂肪含量、基因型之間的關(guān)系如表1。

圖3 H-FABP基因擴增片段

表1 基因頻率及基因型頻率分布

從表1中可以看出:在這個群體中,等位基因A出現(xiàn)的頻率為 0.48,等位基因 B出現(xiàn)的頻率為0.52,基因型為AA出現(xiàn)的頻率為0.24,AB型出現(xiàn)的頻率為0.48,BB型出現(xiàn)的頻率為0.28,基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。三個基因型之間的比率基本為:AA∶AB∶BB=1∶2∶1。

表2 湖南雜交牛H-FABP不同基因型與大理石花紋評分的方差分析

表3 湖南雜交牛H-FABP不同基因型與肌內(nèi)脂肪含量的方差分析

從表2中可以看出:AA型(3.941)的大理石花紋評分值要極顯著高于 AB型(2.131)和 BB型(1.983)(P<0.01),而AB型與BB型差異不顯著(P>0.05);表3中可以看出:AA型(3.941)的肌內(nèi)脂肪含量要極顯著高于AB型(2.131)和BB型(1.983)(P<0.01),AB型要極顯著高于BB型(P<0.01)。

H-FABP不同基因型對湘西黃牛大理石花紋和肌內(nèi)脂肪含量的影響大體一致,呈現(xiàn)AA>AB>BB的趨勢。

3 結(jié)論與討論

湘西黃牛的 H-FABP基因與大理石花紋和肌肉脂肪存在著明顯的相差性。

本研究檢測到A、B兩個等位基因和AA、AB、BB三種基因型,其中B等位基因為優(yōu)勢等位基因,大理石花紋評分值的最小二乘值在AA與AB、BB基因型之間差異顯著(P<0.01),而AB、BB基因型之間差異不顯著(P>0.05);AA型的肌內(nèi)脂肪含量要極顯著高于AB型和BB型(P<0.05),AB型要極顯著高于BB型(P<0.05),說明該多態(tài)性位點對牛肉肌內(nèi)脂肪含量影響極顯著。H-FABP能夠影響肌肉脂肪含量已經(jīng)成為共識,Gerbens[7]等(1997)發(fā)現(xiàn)杜洛克豬的IMF與H-FABP基因顯著相關(guān),王彥[8]等(2007)對 7個品種的雞研究顯示H-FABP基因的兩個位點基因型間IMF存在顯著差異,文力正[9]等(2008)研究發(fā)現(xiàn)H-FABP對牛肉質(zhì)嫩度有顯著影響,而牛肉的大理石花紋與嫩度高度相關(guān)。根據(jù)肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋等級相關(guān)標準發(fā)現(xiàn),大理石花紋豐富程度較低,大理石花紋性狀還有待提高,為了培育優(yōu)質(zhì)高檔牛肉,今后可以通過遺傳選育、加強環(huán)境管理、提高飼養(yǎng)條件等措施來提高大理石花紋等級。

本研究中樣本有效含量有限,將在以后進行的類似檢測工作中,擴大樣本含量進行研究,進而減小誤差。

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