瑪爾江·木坎 庫麗扎達·木拉提
試樣經(jīng)加水均質(zhì)、離心后取上清液,進行杯碟法測定。利用被測樣液中的泰樂菌素殘留量與藤黃微球菌的作用產(chǎn)生抑菌圈,根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈的大小用標準曲線法進行定量測定。
稱取13.3 g無水磷酸二氫鉀加入900 ml水溶解,再加入100 ml 6.2%氫氧化鉀溶液,混勻,于121℃高壓滅菌15 min。
稱取8.5 g氯化鈉,溶于1 000 ml水中,于121℃高壓滅菌15 min。
1 006 μg/mg,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
稱取適量的泰樂菌素標準品,先用少量甲醇溶解,再加水至 1 000 ml,使其濃度達 1 000 μg/ml,置 4 ℃冰箱保存,可使用8 d。
吸取一定量泰樂菌素標準儲備液,分別用緩沖液稀釋成濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml的標準工作液。需當天配制和使用。
1.6.1 培養(yǎng)基Ⅰ(pH值6.1±0.1)
蛋白胨10.0 g,牛肉浸膏5.0 g,氯化鈉2.5 g,瓊脂15.0 g,加蒸餾水至1 000 ml,分裝于試管或克氏瓶中,于121℃高壓滅菌15 min;滅菌后可制成斜面。
1.6.2 培養(yǎng)基Ⅱ(pH值7.0±0.1)
蛋白胨 10.0 g,牛肉浸膏 5.0 g,氯化鈉 2.5 g,加蒸餾水至1 000 ml,分裝于試管中,于121℃高壓滅菌15 min。
1.6.3 培養(yǎng)基Ⅲ(pH值8.5±0.05)
蛋白胨6.0 g,牛肉浸膏1.5 g,酵母浸膏3.0 g,葡萄糖1.0 g,胰水解酪蛋白4.0 g,瓊脂15.0 g,加蒸餾水至1 000 ml,分裝于錐形瓶中,于121℃高壓滅菌15 min。
藤黃微球菌CMCC(28001)由中國生物藥品檢定所提供。
牛津杯:不銹鋼小管,外徑(8.0±0.1)mm,內(nèi)徑(6.0±0.1)mm,高(10±0.1)mm。培養(yǎng)皿:直徑約 90 mm,底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿,具陶瓦蓋。ZY-300Ⅳ多功能微生物自動測量分析儀。均質(zhì)器:不低于10 000 r/min。離心機:不低于8 000 r/min。培養(yǎng)相:(36±1)℃,擱板應(yīng)保持水平。高壓滅菌器,恒溫水浴鍋:(恒溫±1℃)。
將試樣均質(zhì)1 min(5 000 r/min)后,再稱取20 g于離心管內(nèi),加入5 ml水,充分攪勻,放置60 min后,離心20 min(8 000 r/min),取上清液作為樣液。
用約3 ml培養(yǎng)基Ⅱ?qū)⑴囵B(yǎng)基Ⅰ試管斜面上的藤黃微球菌培養(yǎng)物洗下,并移種到克氏瓶中的100 ml培養(yǎng)基Ⅰ的表面上,用滅菌玻璃珠使其均勻地鋪于整個表面,在36℃培養(yǎng)24 h后,用約15 ml滅菌生理鹽水洗下瓊脂表面的培養(yǎng)物,制成菌懸液,置4℃冰箱中可保存2周。
在測定前,需進行預(yù)測試驗,以求得菌懸液最佳用量。用0.1 μg/ml泰樂菌素標準工作液對加有不同量的菌懸液的平板進行測試,經(jīng)培養(yǎng)后能使0.1 μg/ml標準工作液在平板上產(chǎn)生直徑大于或等于10 mm清晰、完整的抑菌圈的菌懸液用量為最佳用量。注入10 ml熔化的培養(yǎng)基Ⅲ于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi),水平靜止,使其凝固,再于已熔化并冷卻至45~50℃的同一培養(yǎng)基內(nèi),加入最佳用量的菌懸液使之充分混合后,取約4 ml注入上述已鋪有培養(yǎng)基Ⅲ的平板上,保持水平,使其凝固,所用平板需當天制備。
用泰樂菌素標準工作液制備標準曲線,以0.2 μg/ml濃度的標準工作液為參考濃度,以0.05 μg/ml濃度的標準工作液作陰性對照,每個標準工作液濃度取3個檢定用平板作為一組,每個平板上置4個牛津杯,使牛津杯在半徑為2.5 cm的圓面呈90°角間距,對角兩個杯中加入0.2 μg/ml參考濃度標準工作液,另兩個對角杯中加入另一種濃度的標準工作液。4個濃度標準工作液共12個檢定平板,用于標準曲線。其中0.2 μg/ml參考濃度的標準工作液將得到24個抑菌圈直徑的數(shù)值,而其他標準工作液分別得到6個抑菌圈直徑的數(shù)值。蓋好陶瓦蓋,置(36±1)℃培養(yǎng)18 h。翻轉(zhuǎn)平板,取出牛津杯,精確地測量各個濃度產(chǎn)生的抑菌圈直徑,求得各自的平均值,再求出0.2 μg/ml參考濃度24個抑菌圈直徑的平均值。
取空白禽蛋精密稱取3份各20.0 g,分別加入濃度為 100 μg/ml標準液 0.5、1.0、2.0 ml,得到添加最終濃度為 8.00、4.00、2.00 μg/ml的添加陽性禽蛋,回收率計算公式:
取添加陽性試料(添加終濃度分別為2.00、4.00、8.00 μg/ml)各3份,按3.1節(jié)方法進行操作,每個濃度至少做3次重復(fù),每次都要同時做標準曲線。
樣品中泰樂菌素殘留量計算公式為:
式中:X——試樣中泰樂菌素的殘留量(mg/kg);
c——從標準曲線上查出的樣液中泰樂菌素的濃度(μg/ml);
m——每毫升最終樣液所代表的試樣量(g/ml)。
標準曲線回歸方程為 y=9.475 7x-14.049,r=0.998 2,其中x為抑菌圈直徑,y為10倍泰樂菌素溶液濃度的對數(shù)值。結(jié)果表明,泰樂菌素在0.1~0.8 μg/ml的濃度范圍內(nèi),抑菌圈直徑與效價濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系,見表1。
表1 線性試驗結(jié)果
試驗證明泰樂菌素在禽蛋中的回收率,達到殘留檢測方法要求的80%,檢出重復(fù)性良好。
①注意樣品的污染。在測定抗生素殘留量時,樣品中抗生素溶液的濃度非常低,因此,取處理樣液時要避免樣品的損失,測定時所用的試驗器具應(yīng)嚴防抗生素殘留和污染。
表2 泰樂菌素在禽蛋中的回收率和重復(fù)性試驗結(jié)果
②在進行菌層預(yù)測試驗時,試驗用的菌種應(yīng)保持新鮮、純潔,菌種的活性,對抗生素反應(yīng)靈敏,菌種對測定影響很大,若菌種不適合,將得不出正確的結(jié)果,菌種不新鮮影響生長速度及靈敏度,一般使用第三代菌種為佳。
③試驗用培養(yǎng)基的靈敏度應(yīng)高,應(yīng)嚴格控制培養(yǎng)基的靈敏度。
④培養(yǎng)溫度對菌種的生長和抑菌圈所致的直徑大小有影響,32℃培養(yǎng)時菌層稀薄,顏色淺,抑菌圈邊緣不清晰,36~37℃培養(yǎng)時菌層密實,顏色顯黃,抑菌圈邊緣清晰。
⑤本文通過調(diào)解菌懸液和培養(yǎng)基的使用量,完全可以是0.1 μg/ml的泰樂菌素標準液產(chǎn)生大于10.0 mm的抑菌圈,所以本法的靈敏度能滿足農(nóng)業(yè)部規(guī)定部頒標準的檢測要求。
[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典一部[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005(附錄):103-109.
[2]張治錟.抗生素藥品檢驗[M](第1版).北京:人民衛(wèi)生出版社,1987.
[3]中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準SN0670—1997.