李永塘 付大波 侯永清 丁斌鷹 劉玉蘭 朱惠玲

在內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激下，為抵抗有害刺激，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體基礎(chǔ)代謝提高、抗體生成上升，氨基酸糖異生的量上升[1]。AKG是谷氨酰胺（Gln）的最佳替代物，可以提高人肌肉內(nèi)游離谷氨酰胺的水平，應(yīng)激狀態(tài)下可促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的合成[2-3]。已有研究表明，應(yīng)激會(huì)影響機(jī)體部分氨基酸的代謝[4]。Lambert等(2002)[5]對(duì)仔豬的研究表明，日糧中添加AKG后能顯著增加門脈中Leu、Lys和Pro的水平，有提高門脈中Ile的趨勢(shì)。肝臟是機(jī)體清除內(nèi)毒素的主要場(chǎng)所，肝臟也是內(nèi)毒素引起的全身炎癥反應(yīng)中受損最嚴(yán)重器官之一[6]。因此LPS刺激可能會(huì)對(duì)仔豬肝臟氨基酸代謝造成影響。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚未見AKG對(duì)免疫應(yīng)激仔豬氨基酸代謝影響的報(bào)道。本試驗(yàn)應(yīng)用多次LPS刺激建立仔豬免疫應(yīng)激模型，研究日糧中添加1%AKG對(duì)免疫應(yīng)激仔豬肝臟氨基酸代謝的影響，為AKG的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脂多糖（LPS）：由Sigma公司提供，大腸桿菌血清型055:B5。α-酮戊二酸(AKG)：含量99.8%，市售醫(yī)藥級(jí)產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫應(yīng)激模型建立

選取健康，來源、體重基本一致的（24±1）日齡斷奶仔豬[杜洛克×長(zhǎng)白×大白，(7.25±0.23)kg]24 頭，隨機(jī)分為3個(gè)處理組，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。3個(gè)處理組分別為：對(duì)照組、應(yīng)激對(duì)照組（LPS組）和試驗(yàn)組（AKG組）。各組基礎(chǔ)日糧一致，空白對(duì)照組和應(yīng)激對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧+1%淀粉，AKG組飼喂基礎(chǔ)日糧+1%AKG。試驗(yàn)期為17 d。LPS組和AKG組仔豬分別于第 10、12、14 和 16 d 腹膜注射 80 μg/kg BW 的LPS，空白對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。在第17 d，所有仔豬用戊巴比妥鈉（50 mg/kg BW）進(jìn)行麻醉后屠宰，取肝臟組織，于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待分析。

1.3 試驗(yàn)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平

基礎(chǔ)日糧參照（NRC 1998）10～20 kg豬的營(yíng)養(yǎng)需要[4]配制(見表1)。AKG組日糧為基礎(chǔ)日糧+1%AKG，對(duì)照組和LPS組的日糧為基礎(chǔ)日糧+1%的淀粉。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

稱取100 mg的肝組織置于勻漿器中,加入1.5 mol/l高氯酸1 ml，勻漿后分別兩次用3 ml的三蒸水漂洗，將漂洗液轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管中，緩慢加入2 mol/l碳酸鉀 0.5 ml，混勻，然后 3 000×g/min 離心 5 min，取上清液于-80℃保存待測(cè)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

采用高效液相色譜法測(cè)定肝臟組織中的18種游離氨基酸：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、絲氨酸（Ser）、瓜氨酸（Cit）、蘇氨酸（Thr）、?；撬幔═au)、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、鳥氨酸（Orn）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）。 具體操作見 Wu 等（2008）[7]的文獻(xiàn)。 采用Waters Breeze高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜條件：色譜柱為Waters XTerra MS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A（0.1 mol/l的乙酸鈉，pH 值 7.2），流動(dòng)相 B（100%甲醇），流速1.1 ml/min；熒光法檢測(cè)器，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340和455 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ONEWAY ANOVA)和Duncan's方法多重比較，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析（見表2）

由表2 可見，LPS 刺激后，肝臟 Asp、Asn、Ser、Cit、Thr、Tau、Trp、Met、Val、Phe、Ile、Leu、Orn 和 Pro 濃度均未受到顯著性影響(P＞0.05)；LPS組肝臟Lys濃度較對(duì)照組有下降的趨勢(shì)（P＜0.1），降低了 20.02%；Tyr濃度降低了18.18%，差異顯著（P＜0.05）。AKG組Glu濃度較對(duì)照組和LPS組均有上升的趨勢(shì)（P＜0.1），分別上升了 20.71%和 15.56%，Ala濃度較 LPS組上升了37.33%（P＜0.1），但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 AKG對(duì)免疫應(yīng)激下仔豬肝臟游離氨基酸含量的影響（nmol/ml）

3 討論

進(jìn)入肝臟的AKG在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用下與丙氨酸反應(yīng)生成谷氨酸和丙酮酸，也可在天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下與天冬氨酸反應(yīng)生成谷氨酸和草酰乙酸。谷氨酸在谷氨酸脫氨酶作用下通過脫氨基產(chǎn)生氨和AKG，而轉(zhuǎn)氨酶催化下將谷氨酸一個(gè)氨基的一部分轉(zhuǎn)移到α-酮酸，形成AKG和相應(yīng)的支鏈氨基酸。AKG還可以與肝內(nèi)的氨結(jié)合生成谷氨酸，谷氨酸再與氨結(jié)合生成谷氨酰胺，因此AKG可以作為NH4+的清除劑。另外，經(jīng)α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的氨基酸有精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸以及谷氨酸等谷氨酰胺族氨基酸，同樣，α-酮戊二酸也能通過三羧酸循環(huán)途徑改變其他氨基酸的代謝，直接或間接發(fā)揮其生理功能。谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸和脯氨酸均為功能性氨基酸，不僅對(duì)動(dòng)物的正常生長(zhǎng)和維持是必需的，而且對(duì)很多生物活性物質(zhì)的合成也是必需的（Wu，2007）[8]。本試驗(yàn)中 AKG 組與 LPS組比較谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸均有所提高。

動(dòng)物處于免疫應(yīng)激時(shí)，機(jī)體的養(yǎng)分從用于生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向優(yōu)先滿足免疫系統(tǒng)代謝改變的需要。動(dòng)物應(yīng)激時(shí)基礎(chǔ)代謝提高、骨骼肌蛋白沉積下降、肝急性期蛋白合成上升、抗體生成上升、氨基酸糖異生的量上升[1]，這就意味著免疫應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物機(jī)體代謝的改變很可能會(huì)影響動(dòng)物的氨基酸需要模式。李建文等（2006）[9]以仔豬[(9.03±0.63)kg BW]為研究對(duì)象，在試驗(yàn)的前1 d、試驗(yàn)第2、4、6 d給應(yīng)激組注射200 μg/kg BW脂多糖，正常組注射等劑量的無菌生理鹽水，結(jié)果表明與正常條件下的氨基酸模式相比，應(yīng)激條件下氨基酸模式中Met和Thr略有下降，而Trp有很大程度的增加（正常情況下Trp為21，應(yīng)激情況下Trp為29），研究還指出：肌肉蛋白質(zhì)與急性期蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異表明，免疫應(yīng)激期內(nèi)對(duì)Phe和Trp的需求增加是為了滿足急性期蛋白質(zhì)合成。高蔚娜等（2008）[10]以大鼠為研究對(duì)象，用H2O2誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，研究了槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激大鼠肝細(xì)胞氨基酸代謝的影響，結(jié)果顯示氧化應(yīng)激下大鼠肝臟Met、His和Ala含量顯著減少，Tau含量增加。Met、His和Ala轉(zhuǎn)氨基后生成的丙酮酸以及應(yīng)激過程中生成Tau都可作為活性氧的清除劑[11]，Met、Tau、His等氨基酸可能是氧化應(yīng)激防御機(jī)制的組成部分，參與哺乳動(dòng)物對(duì)氧化應(yīng)激生理-病理反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Kristensen等（2002）[12]以豬為研究對(duì)象，研究表明通過腸道補(bǔ)充AKG能促進(jìn)體內(nèi)Pro的合成,增加動(dòng)脈血中Pro的含量(P＜0.05),并有增加動(dòng)脈血中Gln的含量的趨勢(shì)（P＜0.1），而Pro對(duì)于膠原蛋白的合成過程起著重要的作用。同時(shí)，通過從腸道添加 AKG能增加門脈中 Leu、Lys和 Pro的濃度 (P＜0.05)，并有提高門脈中 Leu和Ile濃度的趨勢(shì) （P＜0.1）。 Tatara 等（2005）[13]以火雞為研究對(duì)象，通過每天在火雞日糧中添加0.4 g/kg BW的AKG，試驗(yàn)期為97 d，結(jié)果表明 AKG組血漿中 Tau、Pro、Leu的濃度顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），而Gln濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，多次LPS刺激后,仔豬肝臟Tyr含量顯著下降(P＜0.05);Lys含量有下降的趨勢(shì)(P＜0.1)。其可能原因是免疫應(yīng)激增加了肝臟對(duì)Tyr和Lys的需求以用于滿足急性期蛋白的合成。由本試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，AKG組Tyr、Lys的含量與LPS組和對(duì)照組差異均不顯著，并且Ala的含量較LPS組有上升的趨勢(shì)，而Glu的含量較對(duì)照組和LPS組均有上升的趨勢(shì)。其可能原因是AKG能通過直接或間接的途徑激活肝臟Glu和Ala的生成途徑，Glu可能用作受損肝臟修復(fù)的能量供應(yīng)燃料，而Ala可能通過轉(zhuǎn)氨基生成的丙酮酸作為活性氧的清除劑[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明LPS刺激影響了肝臟組織中部分游離氨基酸的含量，而AKG可以在一定程度上緩解LPS刺激對(duì)肝臟氨基酸代謝的影響。

4 結(jié)論

AKG能在一定程度上緩解免疫應(yīng)激對(duì)仔豬氨基酸代謝的影響，減輕LPS刺激對(duì)仔豬肝臟損傷。

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