文愛韻, 尤 鋒 孫 鵬 徐冬冬 吳志昊 馬得友 李 軍張培軍

（1. 中國科學院 海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039）

牙鲆dmrt1基因的克隆及其與P450arom基因的組織表達分析

文愛韻1,2, 尤 鋒1, 孫 鵬1, 徐冬冬1, 吳志昊1, 馬得友1, 李 軍1,張培軍1

（1. 中國科學院 海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039）

通過基因組步移和3’RACE獲得了牙鲆 （Paralichthys olivaceus）dmrt1的cDNA全序列, 該基因開放閱讀框全長 909bp, 其編碼的蛋白具有高度保守的 DM 結(jié)構域, 5’UTR區(qū)含有性別相關轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Sox5的結(jié)合位點。牙鲆dmrt1基因只在牙鲆的性腺中表達, 且在精巢中的表達明顯高于卵巢,表明牙鲆的dmrt1可能是一種性別相關基因。同時, 對牙鲆的另一性別相關基因P450arom在成體各組織的表達分析結(jié)果表明, 該基因除在牙鲆的性腺中有表達外, 在腎臟、脾臟、鰓和腦等其他組織中也有不同程度的表達。牙鲆P450arom基因在性腺中的表達也存在兩性差異, 其表達模式與dmrt1的正好相反, 在卵巢中的表達量明顯高于精巢。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）;dmrt1;P450arom; 兩性差異表達

dmrt（doublesexandmab-3-related transcription factor） 基因家族含有一個高度保守的鋅指樣 DNA結(jié)合基序 DM 結(jié)構域, 一些成員在脊椎動物和非脊椎動物的許多物種中都參與了性別決定[1]。其中,dmrt1是目前發(fā)現(xiàn)從果蠅（Drosophila melanogaster）、線蟲（Caenorhabditis elegans）到小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）唯一保守的性別相關基因, 可能是動物性別決定與性腺發(fā)育的主效基因之一[2]。dmrt1基因已經(jīng)在很多魚類如斑馬魚（Danio rerio）和羅非魚（Oreochromis niloticus）等中進行了克隆和表達研究, 發(fā)現(xiàn)其位于常染色體上, 僅在性腺中表達, 且大多數(shù)都呈兩性差異表達, 在精巢中的表達量高于卵巢, 表明該基因可能與精巢發(fā)育相關[3,4]。但在海水魚類中, 有關dmrt1基因的報道比較少, 僅見到在石斑魚（Epinephelus merra）和黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）等中的相關研究, 結(jié)果也顯示出精巢表達強于卵巢的兩性差異[5～7]。P450arom基因?qū)儆诩毎匮趸富虻囊环N, 其編碼產(chǎn)物芳香化酶是催化雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的一個關鍵酶, 能夠催化某些雄激素（如睪酮和雄烯二酮）轉(zhuǎn)化為雌激素。魚類中有關P450arom基因的克隆和表達研究也已在青 （Oryzias latipes）、羅非魚和石斑魚等中進行了報道, 其表達譜顯示出與雌性性腺的相關性, 即在卵巢強表達, 而在精巢中的表達較弱[8～10]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是中國主要的海水魚類養(yǎng)殖品種, 雌魚比相應的雄魚大[11], 培育單一雌性群體, 可以大大提高單位面積的產(chǎn)量, 因而相關的性別決定及性腺發(fā)育分子機制的研究也備受重視。有關牙鲆性別相關基因的克隆和表達只見于日本學者的有關P450arom[12]、foxl2[13]和amh[14]這 3個基因的報道。其他鲆鰈魚性別相關基因的報道則主要有半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的dmrt1[15]和P450arom[16]基因以及南方牙鲆（Paralichthys lethostigma）[17]和大西洋鰈（Hippoglossus hippoglossus）[18]的P450arom基因的克隆和初步表達研究。而作為唯一在不同物種間保守的雄性性別相關基因,dmrt1基因在牙鲆中還沒有見到研究報道。本研究在克隆得到牙鲆dmrt1基因的基礎上, 對該基因和P450arom基因在牙鲆成魚各組織的差異表達進行研究, 并比較它們在性腺中的兩性表達差異, 明確其與牙鲆雌雄性別的相關性, 為牙鲆等鲆鰈魚類的性別決定機制的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 牙鲆組織樣品的獲得

成熟牙鲆雌雄各3尾（全長30 cm±5 cm）購于山東省青島市南山水產(chǎn)市場, 在中科院海洋所水族培育樓暫養(yǎng), 然后解剖成魚腹部, 取出各組織, 立即儲存于液氮用于RNA的提取。

1.2 基因的克隆與分析

運用基因組步移和 3’RACE的方法進行牙鲆dmrt1基因的克隆。第一次基因組步移用接頭引物（1,2見表1）和兼并引物（3,4見表1）通過巢式PCR的方法從基因組文庫中得到的基因片段, 將其連接到PGM-T載體上進行測序, 序列經(jīng) NCBI序列比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tblastx）, 確定為dmrt1基因片段; 再根據(jù)得到的基因片段設計基因特異性引物（5～10見表 1）, 通過多次基因組步移和一次 3’RACE的巢式PCR擴增, 得到的基因片段拼接起來, 經(jīng)序列比對分析, 最終獲得牙鲆dmrt1基因的cDNA全序列。巢式PCR條件: （1）94℃ 25 s, 72℃ 3 min; 94℃ 25 s,67℃ 3 min, 32 個循環(huán); 67℃ 7 min; （2） 94℃ 25 s,72℃ 3 min, 5個循環(huán); 94℃ 25 s, 67℃ 3 min, 20個循環(huán); 67℃ 7 min?；騿幼訁^(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點通過網(wǎng)上的預測工具 MATCH PROGRAM（www.gene-regulation.com/pub/programs.html#match）中的TRANSFAC 6.0數(shù)據(jù)庫進行預測。

根據(jù)得到的牙鲆dmrt1基因cDNA序列, 運用網(wǎng)上翻譯工具獲得了牙鲆Dmrt1蛋白序列（www.expasy.ch）。用 CLUSTALW（www.ebi.ac.uk）進行蛋白比對,進化樹的構建是采用軟件CLUSTAL X和MEGA3對發(fā)表在GenBank上的各個物種的Dmrt1蛋白序列和牙鲆 Dmrt1蛋白序列進行比對聚類分析而完成的。分子系統(tǒng)進化分析和進化樹構建所用的均為全長蛋白序列, 并應用泊松分布進行進化距離驗證。

1.3 RT-PCR表達研究

RNA 的提取: 取 100 mg組織樣品, 加 1 mL Trizol（購自美國Invitrogen公司）, 用研磨棒研碎后再用加樣槍反復吹打, 充分破碎樣品; 加200 μL氯仿,用力混勻, 室溫放置 3 min, 12 000 相對離心力,4℃離心 15 min; 取上清, 緩慢加等體積異丙醇, 室溫放置10 min, 12 000 相對離心力, 4℃離心10 min;除去上清, 加1 mL 70%的乙醇洗滌沉淀, 7 500 相對離心力, 4℃離心 5 min; 除去上清, 室溫干燥, 加DEPC水溶解RNA; 用RNase free DNase（購自大連Takara公司）消化總RNA中的DNA, 37℃水浴30 min,然后65℃水浴10 min, 終止反應; 電泳檢測RNA的純度。

表1 Genome walking、3’RACE和RT-PCR所用引物Tab. 1 Primers used in genome walking, 3’RACE, and RT-PCR

cDNA第一鏈的合成: 在 1.5 mL 的 PCR 管中依次加入 1 μL Oligo dT（10 mmol/L）, 4 μL DNase 處理的RNA（1 μg/μL）, 用Nuclease-free water（購自上海生工公司）補至 13 μL; 70 ℃熱變性 5 min, 冰浴 2 min后, 稍離心; 再加入5 μL 5×M-MLV 反應緩沖液,5.0 μL 無RNase的dNTP（dATP、dTTP、dCTP和dGTP各 2.5 mmol/L）, 1 μL RNase 抑制劑（40 U/μL, 購自大連 Takara 公司）, 1 μL M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL,購自美國 Promega公司）; 輕彈管壁, 稍離心; 42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h。

RT-PCR: 根據(jù)作者得到的dmrt1和已發(fā)表的P450arom（GenBank accession No. AB017182）的cDNA序列設計了兩對基因特異性引物 Dm1rtF和Dm1rtR, 以及 P45rtF和 P45rtR（11～14見表 1）, 以反轉(zhuǎn)錄得到的成魚組織cDNA為模板, 檢測了dmrt1和P450arom在牙鲆成魚不同組織的表達。β-actin作為內(nèi)參對照（15,16見表1）。PCR反應條件是: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 3 min, 35個循環(huán);72℃ 10 min。

2 實驗結(jié)果

2.1 牙鲆dmrt1基因的結(jié)構

牙鲆dmrt1基因cDNA全序列3373bp（GenBank accession No. EU490514）, 其5’UTR中含有與性別相關的轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Sox5的結(jié)合位點, 開放閱讀框為 909bp（圖 1）。編碼的 Dmrt1蛋白序列（GenBank accession No. ACD62474）全長 303aa, 其中 28-87aa為高度保守的DM結(jié)構域。

圖1 牙鲆dmrt1基因cDNA的結(jié)構Fig. 1 cDNA structure of flounderdmrt1gene

2.2 Dmrt1蛋白分子系統(tǒng)進化樹

根據(jù)GenBank上發(fā)表的脊椎動物Dmrt1蛋白序列, 構建了鄰接分子系統(tǒng)進化樹, 箭頭所示牙鲆Dmrt1與半滑舌鰨等其他硬骨魚類的Dmrt1s聚在了一起（圖 2）。

所用 Dmrt1蛋白序列包括: 人（NP_068770.2）,小鼠（NP_056641.2）, 非洲爪蟾（Xenopus laevis, NM_001096500.1）, 四線鼠蛇（Elaphe quadrivirgata,BAD99161.1）, 澤鱷（Crocodylus palustris, ACD749-14.1）, 中國軟甲龜（Pelodiscus sinensis, BAD99160.1）,雞（Gallus gallus, XP_001232983.1）, 河豚（NP_001-089969.1）, 虹鱒（Oncorhynchus mykiss, NP_0011177-41.1）, 三刺棘魚（Gasterosteus aculeatus, AAW6230-4.1）, 斑馬魚（NP_991191.1）, 青 （Dmy, NP_001098-150.1; Dmrt1, AAL02165.1）, 沼澤鰻（Monopterus albus, AAP80398.1）, 北非鯰魚（Clarias gariepinus,AAQ04554.1）, 半滑舌鰨（ABS31368.1）, 呂宋青

（Oryzias luzonensis, BAH05021.1）, 曼谷青 （Oryzias mekongensis, AAS91464.1）, 綠鰭豚（Tetraodon nigroviridis, AAN74844.1）, 白鱘（Acipenser transmontanus, AAL18252.1）, 蜂巢石斑魚（Epinephelus merra,ACD62372.1）, 銀漢魚（Odontesthes hatcheri, ACG69-835.1）, 大西洋鱈魚（Gadus morhua, ACB97630.1）,南方大口鲇（Silurus meridionalis, ABM54575.1）, 橙點石斑魚（Epinephelus coioides, ABK15558.1）, 大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus, ABK88911.1）, 紅樹林溪 （Kryptolebias marmoratus, ABG89135.1）,弓背青 （Oryzias curvinotus, BAC65996.1）, 斑劍尾魚（Xiphophorus maculatus, AAN65377.1）。

2.3 dmrt1和P450arom基因在牙鲆組織的表達

RT-PCR表達研究結(jié)果顯示, 牙鲆dmrt1基因僅在性腺中表達, 并且在精巢中的表達明顯強于卵巢中的表達。牙鲆P450arom基因在性腺中的表達與

dmrt1基因的表達圖式正好相反, 在卵巢中表達很強,

在精巢中的表達極弱。但是, 牙鲆P450arom基因的表達不僅限于性腺, 在腎臟、脾臟、鰓和腦等其他組織中也有不同程度的表達, 具有較廣的表達譜（圖3）。

3 討論

dmrt基因家族作為一個保守的性別相關基因家族, 先后在哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)。在小鼠、雞和海龜中的相關研究表明, 該基因家族成員之一dmrt1基因, 是繼sry、sox9之后發(fā)現(xiàn)的又一重要的雄性性別和精巢發(fā)育相關基因[1]。Matsuda等[19]發(fā)現(xiàn)了一個只限于在青 精巢中表達的位于 Y染色體上的雄性性別決定基因dmy（double sex/mab-3Domain of Y Chromosome）, 它也屬于dmrt基因家族, 是dmrt1基因的一個拷貝, 是青 中調(diào)控雄性發(fā)育的主效基因。在其他魚類中的初步研究表明,dmrt1基因也參與了雄性性腺的發(fā)育。

圖2 牙鲆Dmrt1蛋白的分子系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of flounder Dmrt1 protein

圖 3 牙鲆dmrt1和P450arom基因在成魚各組織的差異表達Fig. 3 Gene expression patterns of flounderdmrt1andP450aromin tissues

作者克隆得到的牙鲆dmrt1基因cDNA全長為3373bp, 分析發(fā)現(xiàn), 其 5’UTR中含有轉(zhuǎn)錄因子 Sox9和Sox5的結(jié)合位點, 這些轉(zhuǎn)錄因子由性別相關基因編碼, 參與了性腺特別是精巢的發(fā)育, 因此, 牙鲆dmrt1基因也可能與雄性性別相關。由該基因編碼的蛋白也含有dmrt基因家族共有的高度保守的結(jié)構域DM域, 該保守結(jié)構域與半滑舌鰨、河豚和三刺棘魚等其他幾種硬骨魚類Dmrt1蛋白的DM結(jié)構域的同源性均在95%以上[5,15]。根據(jù)包括牙鲆在內(nèi)的多種脊椎動物 Dmrt1蛋白序列構建的鄰接分子系統(tǒng)進化樹看出, 牙鲆 Dmrt1蛋白與半滑舌鰨等硬骨魚類的Dmrt1蛋白聚在了一簇。這些結(jié)果說明性別相關轉(zhuǎn)錄因子 Dmrt1含有的與所調(diào)控的基因啟動子區(qū)結(jié)合的DM結(jié)構域, 在魚類中是高度保守的, 這是該轉(zhuǎn)錄因子蛋白發(fā)揮其生物學功能所必需的。

在一些魚類中已經(jīng)克隆得到了dmrt1基因, 并對該基因在性腺組織中的表達進行了研究。在斑馬魚[3]、羅非魚[4]、河豚[5]、青[20]、虹鱒[21]等魚中的研究發(fā)現(xiàn),dmrt1基因均呈現(xiàn)兩性差異表達, 在精巢中的表達較強。在海水魚類中, 也開展了有關dmrt1基因的兩性差異表達研究, 蜂斑石斑魚[6]、黑鯛[7]和半滑舌鰨[15]中的研究表明,dmrt1基因也都局限于性腺中表達, 且精巢中表達強于卵巢。本研究結(jié)果顯示,牙鲆dmrt1基因也是性腺特異表達的, 并且在兩性性腺中的表達程度不同, 其在精巢中的表達遠遠強于卵巢中的表達。這與其他魚類中有關dmrt1基因的兩性差異表達的研究結(jié)果是相似的。說明在魚類中,dmrt1基因的功能是比較保守的, 參與了性腺特別是精巢的發(fā)育過程。

牙鲆P450arom基因也存在兩性差異表達, 與dmrt1基因表達的圖式正好相反, 卵巢中的表達很強,而精巢中的表達極弱。這一結(jié)果與日本學者[13]的報道是一致的, 他們的研究也發(fā)現(xiàn)牙鲆P450arom基因在卵巢中強表達, 在精巢中弱表達, 并且在由高溫誘導雌核發(fā)育群體獲得的性反轉(zhuǎn)雄性牙鲆性腺中,該基因的表達也比較弱。其他魚類如青[8]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、赤點石斑魚（Epinephelus akaara）[10]、歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）[22]和黑鯛[23]等的P450arom基因的表達也是類似的, 均存在兩性差異表達, 即在卵巢的表達顯著強于精巢的表達。在其他鲆鰈魚類中, 有關P450arom基因的研究也顯示了該基因的兩性差異表達模式, 在半滑舌鰨[18]、南方牙鲆[19]和大西洋鰈[20]中, 該基因在卵巢的表達明顯強于精巢的表達。另外,牙鲆P450arom基因, 與有些魚如半滑舌鰨和石斑魚等類似, 是廣譜表達的, 也就是其表達不僅限于性腺, 在脾臟和腦等其他組織中也有不同程度的表達[12,18]。這些研究結(jié)果說明, 芳香化酶P450arom基因作為一種細胞色素氧化酶基因, 不僅參與了性腺特別是卵巢的發(fā)育, 而且在其他一些組織的發(fā)育過程中也發(fā)揮了作用[8]。

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Received: Apr., 6, 2010

Key words:Paralichthys olivaceus;dmrt1;P450arom; sexual dimorphic expression

Abstract:Whole cDNA sequence of olive flounder （Paralichthys olivaceus） dmrt1 gene was obtained using genome walking and 3’RACE methods. The open reading frame of flounder dmrt1 was found to span 909 bp.Sex-related transcriptional factors Sox9 and Sox5 binding sites were identified in its 5’UTR. Flounder Dmrt1 protein had a high conserved DM domain. Expressions of dmrt1 and P450arom genes in flounder tissues were also studied by RT-PCR. The results showed that both genes were sex-related genes. The dmrt1 gene was gonad-specific, and was sexual dimorphic with much higher expression in testis and much lower expression in ovary. The expression of P450arom in gonads was totally opposite to that of dmrt1. It was higher expressed in ovary and lower expressed in testis. Moreover, flounder P450arom had a broad-spectrum expression pattern,being differentially expressed in some other tissues, such as kidney, spleen, gill and brain.

（本文編輯:譚雪靜）

Cloning of dmrt1 gene and its tissue expression analyses compared with that of P450arom gene in olive flounder（Paralichthys olivaceus）

WEN Ai-yun1,2, YOU Feng1, SUN Peng1, XU Dong-dong1, WU Zhi-hao1, MA De-you1, LI Jun1, ZHANG Pei-jun1
（1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071, China; 2. Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China）

Q75

A

1000-3096（2010）11-0097-06

2010-04-06;

2010-07-16

國家 973項目（2010CB126304）; 國家 863計劃資助項目（2006AA10A404）

文愛韻（1984-）, 女, 四川成都人, 博士, 研究方向為海水魚類的分子遺傳學研究, E-mail: waybio@yahoo.cn