陳 一

[摘要] 本文旨在研究在將間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植于人類羊膜(HAM)后,注入損傷兔體全皮的條件下兔體全皮損傷的修復(fù)效果。4組兔體的全皮有大致相同的五個(gè)缺損傷口,它們分別被不同的藥劑處理,其中:A組被融合自體同源MSC的HAM所處理;B組被融合異體同種MSC的HAM所處理;C組被HAM所處理,同時(shí)注射自體同源的MSC;D組被HAM所處理,同時(shí)注射異體同種的MSC。

在藥劑注入的7、12及15天后,每個(gè)兔體小組內(nèi)兔皮傷口的大小均有所測(cè)量及記錄。一般情況下,藥劑注入25天后幾個(gè)小組兔皮傷口均陸續(xù)愈合。用蘇木精與曙紅對(duì)創(chuàng)口染色并在顯微鏡下觀察,染色區(qū)可觀察到表皮與真皮層顆粒狀組織數(shù)量及其他特征。

其中,A、B兩組在藥劑注入術(shù)后的7、12、15天后傷口愈合相關(guān)數(shù)據(jù)方面進(jìn)展明顯,在皮膚傷口修復(fù)方面表現(xiàn)出最為顯著的效果。且A、B兩組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。

對(duì)A、B兩組進(jìn)行組織學(xué)水平檢查,發(fā)現(xiàn)成熟分化的薄層表皮,以及附著沉積膠原蛋白束的真皮層皮膚組織附件,附件完全恢復(fù);C、D兩組為不成熟分泌薄壁細(xì)胞的致密表皮,真皮層皮膚成纖維細(xì)胞不斷增殖,附件不完全恢復(fù)。因此,填充MSC的HAM的注入對(duì)于兔皮組織缺損修復(fù)起著重要作用,而自體同源MSC與異體同種MSC的植入對(duì)于傷口的愈合情況沒有顯著的效果差異。

[關(guān)鍵詞]羊膜組織 間質(zhì)干細(xì)胞 組織工程移植皮膚組織缺損修復(fù)

簡(jiǎn)介

本實(shí)驗(yàn)選用骨髓干細(xì)胞與羊膜組織融合體修復(fù)缺損的皮膚組織,探討的主要問題是:一、人類羊膜(HAM)與骨髓干細(xì)胞(MSC)融合后注入的修復(fù)效果與HAM、MSC分別注入的修復(fù)效果比較;二、異體同種干細(xì)胞與自體同源干細(xì)胞在修復(fù)過程中的效果比較。

在最近的研究中,異體同種間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)被證明在促進(jìn)傷口愈合方面作用顯著,無論是單獨(dú)注入皮膚傷口處還是與人類羊膜(HAM)融合后注入傷口處。本研究旨在調(diào)查將MSC與HAM融合后植入兔全皮損傷處對(duì)傷口愈合的影響。

一、實(shí)驗(yàn)材料與具體方法

1.取材動(dòng)物:健康白兔。數(shù)量:21只;年齡:15周左右;體重:2-2.5千克。

2.分配方式:其中一只用于異體同種干細(xì)胞的取材;另外20只被隨機(jī)平均分配到A、B、C、D四組中。每組白兔均在相同環(huán)境中喂養(yǎng),食物與水的份量均按標(biāo)準(zhǔn)給予。

3.人類羊膜(HAM)的準(zhǔn)備:提取胎盤材料,在含抗生素的無菌環(huán)溶液中浸泡清除血漬。將羊膜小心剝離,用無菌環(huán)溶液漂洗,上皮朝上放置于硝化纖維紙上于-80℃環(huán)境中保存。使用前取出,于37℃環(huán)境中放置30分鐘,剝離硝化纖維膜,上皮朝上置于載玻片。將羊膜于37℃0.25%胰島素-乙二胺四乙酸中浸泡30分鐘后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗。

4.間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的隔離培養(yǎng):自體同源間質(zhì)干細(xì)胞通過穿刺實(shí)驗(yàn)組中白兔股骨末端而取得;異體同種間質(zhì)干細(xì)胞則取自未被分進(jìn)組內(nèi)的白兔,無菌條件下取得。提取骨髓2ml,置于含肝磷脂的無菌試管內(nèi)。于萃取液中分層篩選出紅血球,將浮于表層的血漿倒掉。將骨髓樣品倒入1.077g/ml Ficoll-Hypaque溶液中,在室溫下以1000r/min的速度離心20分鐘。隨后可用10%胎兒血清和抗生素(100IU/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)在底部溶液中央及溶液界面處提取干細(xì)胞,并以106個(gè)/ml的細(xì)胞密度將其轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內(nèi),周圍氣體環(huán)境潮濕(5%CO2,95%空氣,37℃)。48小時(shí)后第一次換氣,之后每2-3天換一次。原始培養(yǎng)大約持續(xù)7-10天,在此期間,非粘附性的造血細(xì)胞碎片被遺棄。培養(yǎng)細(xì)胞分裂一定次數(shù)后注入0.25%胰島素溶液與0.02%乙二胺四乙酸溶液使之傳代2-3次。

5.間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在人類羊膜(HAM)表面的轉(zhuǎn)染與填充:轉(zhuǎn)染細(xì)胞在使用前于37℃,5%CO2環(huán)境下在全能補(bǔ)給性培養(yǎng)基上放置4小時(shí)。隨后用CD45,73,105, 166流式細(xì)胞計(jì)測(cè)間質(zhì)干細(xì)胞的顯型與純度。將細(xì)胞活素基因(干細(xì)胞因子)轉(zhuǎn)染至曾活體傳代的間質(zhì)干細(xì)胞中,并對(duì)細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光蛋白質(zhì)后融合進(jìn)羊膜,熒光鏡檢確保轉(zhuǎn)染成功。流式細(xì)胞計(jì)分析結(jié)果表明傳代間質(zhì)干細(xì)胞的純度約為85%-97%。

在羊膜組織表面用播種環(huán)劃下填充間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的范圍。轉(zhuǎn)染前3小時(shí)抽離MSC介質(zhì)并置換新鮮培養(yǎng)基。使用磷酸鈣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在無菌試管內(nèi)加入DNA、氯化鈣以及足量的蒸餾水,另一試管內(nèi)加入額定數(shù)量的緩沖鹽溶液。將無菌試管內(nèi)溶液倒入緩沖液,一邊倒入一邊搖勻,倒畢后于室溫放置30分鐘后繼續(xù)搖勻。最后,將溶液倒至HAM所在的培養(yǎng)皿上,輕輕搖晃使之在HAM表面分布均衡。隨后立即用冷凍纖維蛋白黏合劑將間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)融合入羊膜組織內(nèi)并在37℃,5%CO2環(huán)境下結(jié)合。48小時(shí)后進(jìn)行熒光鏡檢,確保MSC與HAM充分融合。

6.實(shí)驗(yàn)操作具體過程:20只白兔被隨機(jī)均分成4組,在無菌室內(nèi)用消毒手術(shù)器械在每只白兔背部劃下位置、面積與深度基本相同的傷口,并在傷口處各取1.5cm×1.5cm的全皮組織。依組別差異,傷口上均勻涂抹相應(yīng)的HAM試劑并縫合傷口。A組5只白兔的傷口涂上融合自體同源MSC的HAM,B組5只白兔的傷口涂上融合異體同種MSC的HAM,細(xì)胞個(gè)數(shù)大約為2×105(融合液2ml);C組5只白兔的全皮組織傷口涂上HAM,隨后注入自體同源MSC,D組5只白兔的全皮組織傷口涂上HAM,隨后注入異體同種MSC,MSC溶液0.5ml。為防止羊膜脫落脫水,傷口采用標(biāo)準(zhǔn)濕敷后將白兔放進(jìn)籠中,避免傷口感染。

7.創(chuàng)口尺寸測(cè)量與組織學(xué)評(píng)估:使白兔呈標(biāo)準(zhǔn)臥姿,對(duì)傷口情況進(jìn)行拍攝并測(cè)量傷口尺寸。移植15天后,傷口基本結(jié)痂;在移植手術(shù)進(jìn)行7天、12天及15天后對(duì)肉眼可見的傷口尺寸進(jìn)行測(cè)量。傷口大多在移植手術(shù)后25天完全愈合。痊愈的損傷區(qū)域上可見一道正常組織的模糊界線(10mm長(zhǎng),10mm寬,5mm深),將損傷分為兩部分。將組織浸入10%福爾馬林液,并牢牢嵌入石蠟中封裝。被蘇木精及曙紅染色的區(qū)域可在顯微鏡下觀測(cè)到表皮與真皮層顆粒狀組織的數(shù)量,從而可精確評(píng)估傷口愈合質(zhì)量。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.取材動(dòng)物:25天后,所有白兔皮膚傷口已經(jīng)完全痊愈,表皮開始再生。

2.創(chuàng)口尺寸測(cè)量:A、B兩組在移植手術(shù)后7天、12天和15天在傷口愈合方面表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的好轉(zhuǎn)特征,因而在修復(fù)缺損上效果明顯。第7天,A組與B組傷口愈合程度分別為45.3±7.2%與43.7±2.8%,而C組與D組傷口愈合程度分別為16.2±4.9%與14.3±6.7%。A組在傷口愈合比率上有輕微高于B組的趨勢(shì),但無明顯數(shù)字特征表明兩者在促進(jìn)傷口愈合能力方面的大小區(qū)別。

3.組織學(xué)評(píng)估: 25天后,A組材料組織的表皮與真皮層都恢復(fù)良好。表皮較薄,細(xì)胞分化成熟,真皮可見不斷分裂的成纖維細(xì)胞。此外存在較輕炎癥反應(yīng),血管分布輕微擴(kuò)張。D組亦可見中心增稠的表皮,真皮纖維化廣泛分布;毛細(xì)血管形成,成纖維細(xì)胞加速分裂,存在輕微炎癥反應(yīng)。C、D兩組皮膚附件亦有部分恢復(fù)。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論:異體同種HAM被用于一系列外科手術(shù)中,或治愈疾病,或代替壞死組織,或用于皮膚、眼角膜、眼球結(jié)膜的慢性傷口包扎。雖然羊膜有很多利于組織缺損修復(fù)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),例如免疫特性、抗菌效果,以及在應(yīng)用中減緩?fù)纯嗟男ЯΦ鹊?但它卻并不一定適宜于臨床應(yīng)用。羊膜的免疫特性具有位點(diǎn)專一性,它也被廣泛應(yīng)用于眼科治療,例如眼角膜---另一個(gè)具免疫特性的位點(diǎn)。異體同種羊膜組織也有其他方面的應(yīng)用,但免疫識(shí)別和應(yīng)答的概率依然保持不變。就目前而言,羊膜以及其細(xì)胞因其較低的免疫原特性而能成為理想的移植組織。

MSC是具有多重效果的細(xì)胞,且可根據(jù)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子系不同組分的活動(dòng)分為不同種類的細(xì)胞。初步臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MSC的自身移植術(shù)可能改善心肌梗死的心臟功能。干細(xì)胞的成形或分化轉(zhuǎn)移過程始終是發(fā)展生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及干細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域研究的核心部分。MSC現(xiàn)則是廣泛應(yīng)用的用于修復(fù)和再生的細(xì)胞來源。雖然干細(xì)胞有著正面作用的治療潛力,但臨床應(yīng)用對(duì)其而言依然需面臨諸多挑戰(zhàn)。毋庸置疑,細(xì)胞移植的小環(huán)境對(duì)于MSC皮膚附件的定位與成型起著至關(guān)重要的作用。

研究結(jié)果表明,間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在與羊膜組織(HAM)融合后注入全皮組織,修復(fù)損傷的效果較為明顯;分別注射間質(zhì)干細(xì)胞與羊膜組織后的全皮組織傷口愈合情況遠(yuǎn)較前者遲緩,但全皮組織在移植干細(xì)胞后出現(xiàn)不明干細(xì)胞特性。干細(xì)胞的作用機(jī)理還需要深層次的實(shí)驗(yàn)探究,探究對(duì)象包括干細(xì)胞末期分化形式以及在非造血組織中的干細(xì)胞可塑性。

總而言之,在兔全皮組織損傷修復(fù)的過程中,羊膜組織的融合對(duì)于骨髓干細(xì)胞移植的修復(fù)皮膚組織缺損效果有極強(qiáng)的推動(dòng)作用。其中,自體同源干細(xì)胞與異體同種干細(xì)胞融合移植效果上無明顯區(qū)別,均具有較強(qiáng)的修復(fù)缺損能力和促進(jìn)再生能力。

參考文獻(xiàn):

[1] Adinolfi M, Akle CA, McColl I, Fensom AH, Tansley L, Connolly P, et al (1982) Expression of HLA antigens, beta 2-microglobulin and enzymes by human amniotic epithelial cells. Nature 295:325–327

[2] Akashi T, Miyagi T, Ando N, Suzuki Y, Nemoto T, Eishi Y, et al (1999) Synthesis of basement membrane by gastrointestinal cancer cell lines. J Pathol 187:223–228

[3] Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, Leibowitz S, McColl I (1981) Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet II:1003–1005

[4] Badiavas EV, Abedi M, Butmarc J, Falanga V, Quesenberry P (2003) Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing. J Cell Physiol 196:245–250

作者簡(jiǎn)介:

陳一(1990-),女,重慶市人,在讀學(xué)士,主要研究方向:生物材料與組織工程。