崔麗瑾,王興龍,2*,任林柱,李曉艷,郎需龍,張付賢,王英超

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130062;2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林長春 130062;3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062)

口蹄疫病毒(Foot-and-m outh disease virus,FMDV)是小RNA病毒科的典型代表,引起偶蹄動(dòng)物的急性接觸性傳染病。由于其血清型眾多,變異頻繁,各血清型之間沒有交叉保護(hù),給該病的防控造成很大困難。2009年1至4月份,我國南方的多個(gè)省份相繼發(fā)生A型、亞洲1型口蹄疫疫情,對口蹄疫防控策略的研究更加緊迫。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是小的短雙鏈 RNA,即小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的對靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的抑制作用,該作用具有高度特異性,已被廣泛作為腫瘤治療和抑制病毒感染的特異性手段,并取得了良好的進(jìn)展。

FMDV基因組為單股正鏈 RNA,全長約8.5 kb,可直接作為信使RNA,是RNAi作用的適合對象。FMDV具有小RNA病毒的共同特征,其RNA的5′末端沒有帽子結(jié)構(gòu)[1],蛋白翻譯起始于5′非翻譯區(qū)中的內(nèi)部順式調(diào)控元件,即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。目前已證實(shí)IRES是FMDV基因組中存在的惟一一個(gè)蛋白翻譯順式調(diào)控元件,它以某種特殊的機(jī)制關(guān)閉宿主細(xì)胞的蛋白合成來合成病毒自己所需的蛋白質(zhì),完成病毒的復(fù)制和裝配,并導(dǎo)致機(jī)體的一系列病理損害。鑒于 IRES在FMDV復(fù)制過程中所起的關(guān)鍵作用,本研究對其序列的保守性和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,篩選了2個(gè)RNA干擾靶位,并構(gòu)建了shRNA真核表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究針對IRES區(qū)域的RNA干擾效果、構(gòu)建口蹄疫病毒RNAi技術(shù)體系提供一定的理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

FMDV WFL株cDNA序列(GenBank登錄號(hào):EF175732,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所第五研究室獲得),大腸埃希菌(E.coli)DH 5α、載體pSilerncer 1.0-U6(Am bion公司)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所動(dòng)物性食品安全研究室第五研究室保存。T4 DNA ligase為Promega公司產(chǎn)品,限制性內(nèi)切酶、DNA M arker、DNA 凝膠回收純化試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,LB培養(yǎng)基為OXOID公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 FMDV IRES序列保守性分析 隨機(jī)選取了GenBank上發(fā)表的7個(gè)血清型的FMDV IRES區(qū)段的cDNA序列28條,與試驗(yàn)用WFL株的相應(yīng)區(qū)段用DNA Star進(jìn)行同源性比對,考察序列的保守性,并尋找最保守的區(qū)域。

1.2.2 FMDV IRES序列二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能區(qū)分析利用網(wǎng)上RNA secondary structure prediction工具對 WFL株 IRES序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://www.genebee.msu.su/services/rna2-re-duced.htmL),并結(jié)合國內(nèi)外對IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能區(qū)域的研究結(jié)果,共同作為siRNA靶序列選擇的參考依據(jù)。

1.2.3 siRNA靶序列的選擇 將試驗(yàn)用FMDV WFL株IRES的 cDNA序列提交Ambion公司的網(wǎng)上siRNA在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.abmion.com/tech lib/m isc/siRNA finder.htmL),在給出的候選干擾靶序列中選擇GC%在30%～60%之間、并經(jīng)網(wǎng)上Blast檢驗(yàn),保留與宿主基因無明顯同源性的序列,參考1.2.1和1.2.2的分析結(jié)果,作為理論篩選確定的siRNA靶序列。

1.2.4 shRNAs表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)U 6載體要求,將選擇的siRNA序列設(shè)計(jì)成shRNA表達(dá)模板的DNA插入序列,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分別合成61 nt的shRNA編碼鏈和53 nt的互補(bǔ)鏈DNA,退火后連接U6載體大片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)菌,涂布于含Amp+的LB瓊脂平板,挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng),小量提取質(zhì)粒[2]進(jìn)行酶切鑒定并交上海鼎安生物科技公司測序。

2 結(jié)果

2.1 FMDV IRES序列的保守性分析

本試驗(yàn)所使用的FMDV WFL株為O型,其全長為8 155 nt,其中,IRES序列在WFL株全基因組中的位置為 602 nt～1 039 nt,長度為 458 nt。經(jīng)DNA Star比對,與GenBank上發(fā)布的7個(gè)血清型FMDV基因組的相應(yīng)序列的同源性在73.5%～100%之間,特別是除南非(SAT)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之外的O、A、C和A sia 1型之間的同源性高于86.4%,說明FMDV的IRES區(qū)段保守性較好,適合作為RNA i的靶區(qū)段。

2.2 FMDV WFL株IRES序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及功能區(qū)分析結(jié)果

利用網(wǎng)上在線 RNA secondary structure prediction工具對WFL株IRES序列進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出,IRES序列在不同部位形成了莖(stem region)和環(huán)結(jié)構(gòu),siRNA序列的選擇應(yīng)盡量避開復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),選擇容易結(jié)合的環(huán)(loop region)部。Pilipenko E V等[3]對3株腦心肌炎病毒、3株FMDV和3株Theiler鼠腦心肌炎病毒的IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明,上述毒株的IRES均具有相同的5個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊。而且上述毒株的IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)擁有部分相同的單鏈序列。張顯升等[4]的研究表明,通過 IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,第72、164、207、208、377和406位點(diǎn)均位于所有毒株IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)的環(huán)中。而 IRES的第373～405位非常保守,序列為TTCTT(A)TAAAAGC(T)GC(T)CCC(T)AGTTTAAAAAGCTTCTA,此區(qū)域的A/T含量高達(dá)73%,而且在這個(gè)區(qū)域的兩翼富含G/C。因此,推斷這個(gè)區(qū)域可能是FMDV的復(fù)制原點(diǎn)(病毒編碼的依賴RNA的RNA聚名酶結(jié)合位點(diǎn)),或是與翻譯起始或某些蛋白因子的識(shí)別或結(jié)合有關(guān)的位點(diǎn)[5]。

圖1 IRES序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測效果圖Fig.1 The secondary structure prediction of IRES sequence

2.3 靶序列的選擇結(jié)果

參照Am bion公司的 siRNA在線設(shè)計(jì)軟件給出WFL株的IRES序列的siRNA干擾靶序列結(jié)果,經(jīng)Blast檢驗(yàn),去除與宿主存在同源的序列,結(jié)合序列保守性分析、基因序列功能區(qū)分析,確定了分別針對265 nt～283 nt和395 nt～413 nt的2個(gè)siRNA干擾靶序列,分別處于在圖1上標(biāo)注的 A(IRES-12)和B(IRES-20)位置,其核酸序列見表1,其中IRES-20位于多分支環(huán)(m ultibranched loop)中,屬于siRNA最易結(jié)合部位;IRES-12位于發(fā)夾環(huán)(hairpin loop)中,屬于比較易結(jié)合部位。其保守性分析結(jié)果如圖2所示,可見 IRES-12、IRES-20在7個(gè)血清型間都表現(xiàn)出很高的同源性。

表1 siRNA的靶序列Table1 Target sequences of siRNA

2.4 pSilencer 1.0-U6-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

合成的單鏈DNA插入序列為由9 nt的非互補(bǔ)堿基(即小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的“環(huán)”)分割的反向互補(bǔ)序列,以保證在U 6啟動(dòng)子指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄成單鏈時(shí),能按堿基互補(bǔ)原則形成小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子(shRNA)(表2)?；パa(bǔ)的DNA模板退火后分別形成ApaⅠ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn)的黏性末端,與同樣經(jīng) ApaⅠ和Eco RⅠ雙酶切線性化的pSilencer1.0-U 6載體片段連接,小提重組質(zhì)粒以 Hin dⅢ酶切進(jìn)行初步鑒定,證明外源片段已連入載體(圖3),之后,經(jīng)測序和序列分析,表明 shRNA表達(dá)片段插入正確,U6啟動(dòng)子序列無突變發(fā)生,圖4為測序峰圖,序列下劃線部分為插入序列的莖環(huán)部。

圖2 siRNA靶序列同源性分析結(jié)果Fig.2 H om ology analysis for target sequences of siRNA

表2 針對載體pSilencer1.0-U6表達(dá)shRNA的DNA插入序列Table2 DNA insert sequences exp ressing shRNAs for the vector pSilencer1.0-U 6

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasm ids by endonu clease digestion

圖4 重組質(zhì)粒插入序列部分的測序峰圖Fig.4 Sequencing diagram of the insert sequence of recombinan t plasm id

3 討論

RNA干擾對靶RNA的降解,不僅能夠抑制病毒蛋白成分的產(chǎn)生,同時(shí)能夠直接減少病毒的數(shù)量,并抑制其在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,達(dá)到最終清除病毒的目的,因此其對病毒性疾病的防控具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。國內(nèi)外一些學(xué)者已經(jīng)開展了關(guān)于FMDV的RNA i的研究,但因所選擇的siRNA的序列不同,所報(bào)道的對 FMDV的抑制效果差異很大。Ronen K等[6]報(bào)道針對FMDV 3B和3D基因設(shè)計(jì)的siRNA對FMDV的抑制效率可達(dá)100%。Chen W Z等[7]研究了siRNA對FMD表面抗原蛋白VP1基因的抑制作用,結(jié)果表明,在BHK-21細(xì)胞中siRNA表達(dá)質(zhì)粒可使FMDV VP1基因的表達(dá)降低80%～90%。de Los Santos T等[8]證明針對FMDV基因非編碼區(qū)設(shè)計(jì)的shRNA可有效地抑制多種血清型的FMDV復(fù)制。

由于FMDV像其他的RNA病毒一樣,具有很高的遺傳多態(tài)性,迄今為止,血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了多達(dá)7種的血清型和超過60種的亞型,而且,每個(gè)亞型都有許多基因組變異的毒株[9]。因此,針對病毒基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA是利用RNA干擾技術(shù)抑制病毒增殖的關(guān)鍵。其干擾靶序列的保守性越高,作用于各種血清型的干擾潛力就越大。

IRES是小RNA病毒翻譯起始的調(diào)控元件,在FMDV復(fù)制過程中起著非常重要的作用。張顯升等[4]對China/99等包括 O、A、Asia I等血清型的8條FMDV IRES序列進(jìn)行了比對,發(fā)現(xiàn)China/99株與 O1 K 、O1 Campos、A sia 1 、A 24、A 12、TWCP/97和TW TY/97等7個(gè)毒株的IRES核苷酸序列無明顯的差異,表明該段序列較為保守。從本研究給出的序列比對直觀結(jié)果(圖2)可以看出,所選siRNA干擾靶位點(diǎn)序列大部分在流行較為廣泛的O、A、C、Asia 1型之間保守性比較高,也有部分序列在7個(gè)血清型都呈現(xiàn)較好的保守性,說明所選擇的siRNA序列有很好的干擾FMDV復(fù)制的潛力。雖然有悖于干擾設(shè)計(jì)時(shí)選用編碼這為靶位的一般原則,但該區(qū)域的高度保守性及重要功能決定了它可以作為干擾的理想靶位。

研究還表明,在m RNA中局部形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響siRNA的靶位點(diǎn)可及性[10],因此,正確地預(yù)測m RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力,可能是獲得高效siRNA的一個(gè)重要因素。Hellen C V等[11]根據(jù)對一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列、結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)變異分析,報(bào)道過小RNA病毒科的IRES至少有兩種類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形。他提到,由于都是以專業(yè)軟件進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測,因此還無法斷定何種二級(jí)結(jié)構(gòu)最為正確,但二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測卻能為今后的研究提供必不可少的依據(jù)。本研究利用網(wǎng)上專業(yè)工具對IRES的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,以便考察備選的siRNA序列在基因序列二級(jí)結(jié)構(gòu)中的大致位置,為干擾位點(diǎn)的選擇提供了一種參考依據(jù)。

目前,RNAi技術(shù)的應(yīng)用研究發(fā)展迅速,然而并非所有指向靶基因的siRNA在導(dǎo)入細(xì)胞后都能夠產(chǎn)生RNAi,其中siRNA序列的設(shè)計(jì)、篩選和導(dǎo)入都非常關(guān)鍵。siRNA的有效性高度依賴其特定靶位點(diǎn)的確定,而關(guān)于siRNA序列的選擇,目前尚無完全統(tǒng)一的準(zhǔn)則,幾大研究機(jī)構(gòu)的網(wǎng)站及公司的設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的siRNA的序列也有不統(tǒng)一之處。本研究通過對IRES序列的全面分析,選擇了針對FMDV復(fù)制的重要功能區(qū),且高度保守、易于結(jié)合的2個(gè)干擾靶位,構(gòu)建了shRNA表達(dá)質(zhì)粒,利用這種具有反折結(jié)構(gòu)的DNA模板可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成眾多的shRNA,啟動(dòng)RNAi的效應(yīng),避開了RNA操作的困難,為應(yīng)用RNA i技術(shù)防控和抑制FMDV感染進(jìn)行了有益探索。

[1]Sangar D V,Row lands D J,Brow n F,et al.Protein covalen tly linked to foot-and-mouth disease virus RNA[J].Nature,1977,268(5621):648-650.

[2]薩姆布魯克 J,拉塞爾 DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002:30-32.

[3]Pilipenko E V,Blinov V M,Chernov B K,etal.Conservation of the secondary structure elements of the 5′-un translated region of cardio-and aph thovirus RNAs[J].Nucleic Acids Res,1989,17(14):5701-5711.

[4]張顯升,任 艷,魏艷麗,等.小RNA病毒蛋白翻譯調(diào)控元件研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2004,24(6):6-11.

[5]孫乃恩,孫東旭,朱德煦.分子生物學(xué)[M].江蘇南京:南京大學(xué)出版社,1996:7-200.

[6]Kahana R,Kuznetzova L,Rogel A,et al.Inhibition of footand-mouth disease virus replication by sm all in terfering RNA[J].JGen V irol,2004,85:3213-3217.

[7]Chen W Z,YanW Y,Du Q Y,et al.RNA Interference targeting VP1 inhibits foot-and-mouth disease virus replication in BHK-21 cellsand suck ling m ice[J].JV irol,2004,78(13):6900-6907.

[8]de Los Santos T,W u Q H,de Avlia Botton S,et al.Short hairpin RNA targeted to the high ly conserved 2B nonstru ctural p rotein coding region inhibits replication of m ultiple serotypes of foot-and-mouth disease virus[J].V irology,2005,35(2):222-231.

[9]Sob rino F,Saiz M,Jim enez-C lavero M A,et al.Foot-andm ou th disease virus:a long know n virus but a cu rrent th reat[J].Vet Res,2001,32:1-30.

[10]K retschmer-Kazem i Far R,Sczakiel G.The activity of siRNA in mamm alian cells is related to structu ral target accessibility:a comparison w ith antisense oligonuc leotides[J].Nuc leic Acids Res,2003,31:4417-4424.

[11]Hellen C V,Wimm er T.T ranslation of encephalomyocarditis virus RNA by in ternal ribosome en try[J].Curr Top M icrobiol Imm unol,1995,203:31-63.