曾凡星,朱 晗,趙 華,歐陽芡

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京100084;2.天水師范學(xué)院體育學(xué)院,甘肅天水741001)

運(yùn)動(dòng)和PI3K阻斷劑對(duì)大鼠骨骼肌mT OR及下游信號(hào)的作用研究

曾凡星1,朱 晗1,趙 華2,歐陽芡1

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京100084;2.天水師范學(xué)院體育學(xué)院,甘肅天水741001)

目的:通過觀察一周注射PI3K阻斷劑和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)mTOR及其下游信號(hào)的影響,深入探討PI3K對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌蛋白合成信號(hào)的機(jī)理。方法:8周齡雄性SD鼠在適應(yīng)性訓(xùn)練后分為四組:安靜組(S)、阻斷劑組(SL)、運(yùn)動(dòng)組(E)、運(yùn)動(dòng)+阻斷劑組(EL),每組6只。運(yùn)動(dòng)方式為跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(坡度為10%,跑速20m/min,60min),每天一次,共7天。腹腔注射外源性LY294002。用Western Blotting法檢測腓腸肌MHC、mTOR(Ser2448)、p70S6K(Thr389)和4EBP1(Thr37/46)的磷酸化表達(dá)。結(jié)果:在一周后,LY294002明顯抑制MHC,運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)的趨勢,并減弱LY294002對(duì)MHC的抑制效應(yīng)。LY294002顯著抑制mTOR(Ser2448)、p70S6K(Thr 389)和4EBP1(Thr 37/46)的磷酸化表達(dá),而運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)其表達(dá)。外源性LY294002和運(yùn)動(dòng)因素間存在交互效應(yīng),LY294002減弱運(yùn)動(dòng)對(duì)此通路的促進(jìn)效應(yīng)。結(jié)論:1)一周外源性PI3K阻斷劑注射明顯抑制mTOR及下游信號(hào),并能顯著抑制運(yùn)動(dòng)所引起的蛋白促合成效應(yīng)。2)mTOR的兩個(gè)下游信號(hào)對(duì)運(yùn)動(dòng)均較敏感,但4EBP1對(duì)PI3K阻斷劑的反應(yīng)較為遲鈍。

PI3K;LY294002;mTOR通路;骨骼肌肥大;運(yùn)動(dòng)

骨骼肌蛋白質(zhì)代謝是機(jī)體在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練適應(yīng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前對(duì)這種適應(yīng)機(jī)制的研究主要關(guān)注于骨骼肌內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌肥大過程的主要合成信號(hào)通路為PI3K/Akt/mTOR通路[1]。前期研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)可以有效地增強(qiáng)mTOR及下游信號(hào)的磷酸化反應(yīng)。但使用在體阻斷骨骼肌PI3K信號(hào)結(jié)合運(yùn)動(dòng)研究mTOR及下游信號(hào)鮮見。以mTOR及其下游信號(hào)(p70S6K和4EBP1)為著眼點(diǎn),觀察該通路在注射一周PI3K阻斷劑的耐力運(yùn)動(dòng)模型中的變化特征及與蛋白合成的關(guān)系,研究PI3K對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌蛋白合成的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

健康雄性、SPF級(jí)8周齡SD大鼠,體重(177.8±5.4)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料,分籠飼養(yǎng),4只/籠。自由飲食,溫度維持在22℃～24℃,相對(duì)濕度50%～65%。晝夜節(jié)律人工控制光照(光照時(shí)間為8∶00～20∶00)。

在適應(yīng)性訓(xùn)練后,動(dòng)物經(jīng)體重分層后隨機(jī)分為四組:安靜組(S)、阻斷劑組(SL)、運(yùn)動(dòng)組(E)、運(yùn)動(dòng)+阻斷劑組(EL),每組6只。各組體重在正式分組前無組間差異。

1.2 動(dòng)物運(yùn)動(dòng)方案

正式訓(xùn)練前,動(dòng)物在跑臺(tái)上進(jìn)行4天的適應(yīng)性訓(xùn)練,之后休息3天。適應(yīng)性訓(xùn)練方案見表1。

表1 動(dòng)物適應(yīng)性訓(xùn)練方案

正式實(shí)驗(yàn)共7天,安靜組常規(guī)飼養(yǎng),運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行7天的運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)方案為上坡跑(坡度為10%)、速度20m/min,每天訓(xùn)練60min(根據(jù)Bedford經(jīng)驗(yàn)公式,相當(dāng)于75%VO2max)[2]。運(yùn)動(dòng)時(shí)間為每日上午8∶00～9∶00。

1.3 LY294002注射方案

LY294002(購自Cayman ChemicalCompany公司,產(chǎn)品批次為0400072-24)為PI3K的特異性阻斷劑[3],采用大鼠腹腔注射。每天運(yùn)動(dòng)后即刻,SL和EL組在大鼠腹腔注射LY294002。其他組注射同等劑量的安慰劑。具體劑量安排如表2。

表2 LY294002注射劑量安排表

1.4 測試樣本采集與處理

取材前禁水禁食12h,以0.3mL/100g為劑量,腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹主動(dòng)脈取血,然后速取后肢腓腸肌。接著用生理鹽水將其洗凈,剔除肌腱及筋膜組織,用干凈濾紙將其吸干,用錫紙將其包裹后迅速投入液氮,而后置于-80℃冰箱保存待測。

1.5 指標(biāo)測試方法

1.5.1 提取蛋白 勻漿緩沖液的配制:取R IPA裂解液100mL,分別加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑(Roche公司)各10片,最后取100mM PMSF 1000μL加入。PMSF于臨用前數(shù)分鐘加入。于勻漿前新鮮配制。

用精密天平稱取腓腸肌120mg,用眼科剪迅速剪碎,按1∶10比例向玻璃勻漿器中加入預(yù)冷的裂解液,再在冰水浴中進(jìn)行勻漿,直至沒有肉眼可視的懸浮物。將組織勻漿液倒入1.5mL EP管中,靜置10min。于4℃,12 000g,10min離心,取上清液,分裝后保存于-80℃待測。

1.5.2 蛋白濃度測試法(Bradford) 配制Bradford工作液:按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》配制[4]。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:用1 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白分配制0、10、20、40、60、80、100ug梯度。加入5mL Bradford工作液,用旋渦混勻器混勻后靜置5min。測A595nm。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再分批次測試樣品濃度。

1.5.3 Western Blot測試 Tris-甘氨酸電泳緩沖液、上樣緩沖液、電轉(zhuǎn)液、堆積膠和分離膠的配制均參照《Current protocols in protein science》實(shí)驗(yàn)方法[5],TBS、TBST、封閉液按照Cell Signaling抗體說明書的要求配制。

取100μg總蛋白配制成上樣體系,置95℃沸水中5min,再于4℃中冷卻,上樣前以3 000rpm離心5min。配制分離膠6%(MHC、mTOR)、8%(Actin、p70S6K)、10%(β-actin)或16.5%(4EBP1)以及5%濃縮膠。濃縮膠用80V恒壓,分離膠換120V恒壓電泳。再用半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上,以恒壓20V半干轉(zhuǎn)。封閉90min后用加入一抗,不同抗體稀釋比例分別為β-actin(購自Santa Cruz公司)為1:500,FastMyosin Skeletal Heavy chain antibody[MY-32](Abcam公司)為1∶2000,Phospho-mTOR(Ser2448)(Cell Signaling公司)為1∶800,Phospho-p70S6K(Thr389)(Cell Signaling公司)為1∶1200,Phospho-4E-BP1(Thr37/46)(Cell Signaling公司)為1∶800,然后4℃孵育過夜。次日晨用TBST洗膜后用不同濃度二抗室溫孵育60min。用ECL發(fā)光試劑與膜在暗室中反應(yīng)、曝光。曝光底片用凝膠成像系統(tǒng)的透光拍照,用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析。將每個(gè)條帶與相應(yīng)樣品的β-actin條帶光密度值進(jìn)行比較,計(jì)算出目的條帶的相對(duì)含量值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 13.0軟件。組間比較采用雙因素方差分析(UN IANOVA)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。對(duì)觀測點(diǎn)的組間多重比較(Post Hoc)采用LSD或Tamhane’s T2方法分析。顯著性檢驗(yàn)水平以P＜0.05表示具有顯著性差異,P＜0.01表示具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

在一周的實(shí)驗(yàn)后,分別測得各個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組腓腸肌的MHC和mT OR及其下游信號(hào)表達(dá)值,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、圖1。

表3 LY294002和運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠M HC和mTOR及下游信號(hào)表達(dá)值(相對(duì)含量)

在一周后,LY294002(F=10.305,P＜0.01)明顯抑制MHC,運(yùn)動(dòng)(F=2.388,P＞0.05)有促進(jìn)的趨勢,并減弱LY294002對(duì)MHC的抑制效應(yīng)。LY294002顯著抑制mTOR(Ser2448)(F=25.342,P＜0.01)、p70S6K(Thr389)(F=38.083,P＜0.01)和4EBP1(Thr37/46)(F=3.455,P＜0.05)的磷酸化表達(dá),而運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)表達(dá)。外源性LY294002和運(yùn)動(dòng)因素間存在交互效應(yīng),運(yùn)動(dòng)減弱LY294002對(duì)此通路的抑制效應(yīng)。具體表現(xiàn)為S組和E組的MHC均顯著高于SL組(分別為17.6%和20%)。E組的mTOR(Ser2448)磷酸化顯著高于SL組和EL組(分別為32.9%和22.8%)。S組和E組的p70S6K(Thr389)磷酸化均顯著高于SL組(分別為25%和52.5%),EL組顯著高于SL組(20%)。E組的4EBP1(Thr37/46)磷酸化顯著高于S組、SL組和EL組(分別為34%、36.7%和15.5%)(圖1)。

圖1 LY294002和運(yùn)動(dòng)干預(yù)下大鼠腓腸肌M HC和mTOR及其下游信號(hào)表達(dá)圖

3 討論

3.1 PI3K阻斷劑對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌蛋白合成的影響

PI3K為IGF-I發(fā)揮促合成效應(yīng)信號(hào)中非常重要的一個(gè)信號(hào)。PI3K在受其上游信號(hào)如生長因子、胰島素等激活后[6-7],其在細(xì)胞膜上將二磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為三磷脂酰肌醇(PIP3),然后以PIP3作為第二信使啟動(dòng)下游的蛋白[8]。對(duì)PI3K信號(hào)的阻斷,能夠很大程度地影響位于其下游的Akt和mTOR信號(hào)[9]。因而形成IGI-I/PI3K/Akt/mTOR通路,影響機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝過程。在該通路中的mTOR信號(hào)分子及其下游信號(hào)是肌肉肥大過程中的關(guān)鍵因子。Bodine(2001)等[1]發(fā)現(xiàn)使用mTOR信號(hào)分子的特異性阻斷劑——雷帕霉素,能阻斷95%的肌肉肥大效應(yīng)。

LY294002為PI3K的特異性抑制劑,它能抑制PI3K家族的活性,這種抑制效應(yīng)呈一定的劑量依賴[3]。研究實(shí)驗(yàn)所取材組織為腓腸肌,為典型的以快肌纖維為主的肌肉,其MHCIIb型達(dá)到約90%,IId/x型約10%[10]。本研究測試的MHC為快肌型。研究結(jié)果顯示,一周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有促進(jìn)腓腸肌MHC增加的趨勢(P＞0.05),LY294002明顯抑制MHC(P＜0.01),并明顯抑制運(yùn)動(dòng)對(duì)MHC的促進(jìn)效應(yīng)。MHC的減少意味著肌肉收縮蛋白的丟失。PI3K阻斷劑能抑制肌肉收縮蛋白的合成,并能顯著抑制運(yùn)動(dòng)所引起的促合成效應(yīng)。

3.2 PI3K阻斷劑對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌mTOR及下游信號(hào)的影響

mTOR的促合成效應(yīng)主要是通過對(duì)p70S6K和4EBP1的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。mTOR的下游信號(hào)p70S6K磷酸化后,能促進(jìn)5’TOPmRNA翻譯,提高mRNA的翻譯能力[11,12];另外一個(gè)下游信號(hào)4EBP1磷酸化后可調(diào)節(jié)eIF4E的活性,來提高翻譯的起始效率,從而促進(jìn)翻譯的起始和延伸過程,增加蛋白合成[13],最終導(dǎo)致骨骼肌肥大。mTOR的這兩種下游信號(hào)能被雷帕霉素所阻斷,并能在離體情況下被重組mTOR所激活[14,15]。Fujita等[16]發(fā)現(xiàn)促人體合成的營養(yǎng)素能敏感地被mTOR所感受到,引發(fā)一個(gè)迅速地和有效地通過加強(qiáng)翻譯的起始和延伸過程(mTOR、p70S6K、4EBP1磷酸化均顯著增加),來促進(jìn)人骨骼肌蛋白的合成。在體情況下,由Akt/mTOR通路所激活的基因能充分地引起肌肉肥大,阻止肌肉萎縮;而它們的阻斷劑能阻斷在體情況下的肌肉肥大。本研究發(fā)現(xiàn),一周注射LY294002能夠使mTOR(Ser2448)蛋白磷酸化水平顯著抑制約15%。

p70S6K參與mRNA轉(zhuǎn)錄的起始過程,它被認(rèn)為是這一過程所必需的[12]。雖然這些轉(zhuǎn)錄僅為100到200個(gè)基因,但他們能編碼細(xì)胞mRNA的20%。這些編碼的產(chǎn)物有核糖體蛋白、延長因子等,這些都是蛋白質(zhì)生物合成的基因,p70S6K調(diào)控著翻譯組件的生物合成[17]。它可以磷酸化調(diào)節(jié)mRNA翻譯過程中的至少3種蛋白,包括elF4B、核糖體蛋白S6和真核翻譯延伸因子eEF2。其Thr389位點(diǎn)的磷酸化是p70S6K被激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn),一周注射LY294002能使p70S6K(Thr389)蛋白磷酸化水平顯著抑制約20%。

4EBP1即eIF4E結(jié)合蛋白,又稱PHAS1。真核細(xì)胞mRNA翻譯的有效起始依賴于eIF-4F復(fù)合體,后者由eIF-4E、eIF-4A、eIF-4G組成。eIF-4E和eIF-4G的活性被eIF-4E結(jié)合蛋白——4EBP所抑制。4EBP1能抑制翻譯起始所必需的帽子結(jié)構(gòu),進(jìn)而控制翻譯過程[18]。Gregory[14]HEK293細(xì)胞的鼠PHAS-1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染,或者用野生型mTOR,或者用雷帕霉素抵抗型mTOR的基因突變,發(fā)現(xiàn)不管是在體還是離體,4EBP1激酶的活性受到mTOR功能的直接影響。本研究發(fā)現(xiàn),一周注射LY294002能使4EBP1(Thr37/46)蛋白磷酸化水平顯著抑制約2%。

本研究顯示,一周的實(shí)驗(yàn)后,mTOR及其兩個(gè)重要下游信號(hào)p70S6K和4EBP1的活性均表現(xiàn)出明顯抑制,且變化趨勢相似。在mTOR活性表達(dá)有一定抑制后,位于其下游的p70S6K和4EBP1的活性均有更為顯著的變化。這些結(jié)果提示LY294002通過抑制PI3K后,通過mTOR作用于其下游信號(hào)p70S6K和4EBP1,從而對(duì)蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——翻譯過程產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

通過前期的研究,本研究所選用的模型為具有抗阻效應(yīng)的跑臺(tái)練習(xí)[19,20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LY294002顯著抑制mTOR(Ser2448)(P＜0.01)、p70S6K(Thr389)(P＜0.01)和4EBP1(Thr37/46)(P＜0.05)的磷酸化表達(dá),而運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)其表達(dá)。外源性LY294002和運(yùn)動(dòng)因素間存在交互效應(yīng),運(yùn)動(dòng)減弱LY294002對(duì)此通路的抑制效應(yīng)。

3.3 PI3K阻斷劑和運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌mTOR及下游信號(hào)影響

研究結(jié)果表明,PI3K阻斷劑抑制骨骼肌蛋白合成,運(yùn)動(dòng)促進(jìn)其蛋白合成,且能減弱PI3K阻斷劑對(duì)MHC的抑制效應(yīng)。表現(xiàn)為一周的實(shí)驗(yàn)后,LY294002明顯抑制MHC,運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)的趨勢,并減弱LY294002對(duì)MHC的抑制效應(yīng)。此外,運(yùn)動(dòng)和LY294002對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌mTOR及其下游信號(hào)影響的側(cè)重點(diǎn)有所不同。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示,LY294002對(duì)該通路的影響是整體性的,通過對(duì)PI3K的直接抑制,而使其下游信號(hào)受到相當(dāng)?shù)挠绊憽１狙芯拷Y(jié)果顯示,在阻斷PI3K后,4EBP1活性的變化并不明顯,只有2%的降低;而對(duì)運(yùn)動(dòng)則更為敏感,有34%的升高。而p70S6K則表現(xiàn)出對(duì)二者均相當(dāng)敏感。對(duì)PI3K的阻斷,可使p70S6K有20%的降低;而相對(duì)于運(yùn)動(dòng),則有22%的升高。而mTOR信號(hào)的變化幅度基本小于其下游信號(hào)的變化,對(duì)PI3K阻斷劑和運(yùn)動(dòng)分別有15%的降低和13%的升高。顯示出mTOR作為始動(dòng)因素,其下游信號(hào)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。mTOR的兩個(gè)下游信號(hào)對(duì)運(yùn)動(dòng)均較敏感,但4EBP1對(duì)PI3K阻斷劑的反應(yīng)似乎較為遲鈍。

4 結(jié)論

1)一周外源性PI3K阻斷劑注射明顯抑制mTOR及下游信號(hào),并能顯著抑制運(yùn)動(dòng)所引起的蛋白促合成效應(yīng)。

2)mTOR的兩個(gè)下游信號(hào)對(duì)運(yùn)動(dòng)均較敏感,但4EBP1對(duì)PI3K阻斷劑的反應(yīng)較為遲鈍。

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責(zé)任編輯:喬艷春

Exercise and Blocking PI3K on mTOR and Downstream s of mTOR of SkeletalM uscle in Rats

ZENG Fanxing1,ZHU Han1,ZHAO Hua2,OU YANG Q ian1
(1.School of Hum an Sports Science,Beijing Sport U niversity,B eijing100084,China;2.Sports School,Tianshui N orm al U niversity,Tianshui741001,Gansu,China)

A im:the purpose of this study was to exam ine the effect of m TOR and dow nstream of m TOR on m uscle protein synthesis in resistance treadm ill exercise m odel through blocking PI3K in vivo.M ethods:adult m ale Sprague-D aw ley rats(8w eeks old)were random ly divided into4groups after adaptive training:sedentary(S),LY294002group(SL),exercise group(E)and LY294002plus exercise group(EL).The follow ing treadm ill training w as applied:20m/m in at10%slope,60m in;once per day,7days.Rats w ere treated daily w ith Either8%ethanol orLY294002(5.5m g/kg,diluted w ith 8%ethanol)intraperitoneal injection for7days.The M HC and phosphorylation of m amm alian target of rapam ycin(m TOR)(Ser2448),70-kD a ribosom al protein S6kinase(p70S6K)(Thr389),eIF4E binding protein1(4EBP1)(Thr37/46)of gastrocnem ius m uscle w ere determ ined byW estern blotting.Results:after1week,M HC was significantly inhibited by L Y294002.Exercise had a tendency to increase M HC,and it attenuated the inhibitory effect of LY294002on M HC.Phosphorylation of m TOR(Ser2448)(P＜0.01),p70S6K(Thr389)and4EBP1(Thr37/46)w ere significantly inhibited by LY294002,but they w ere elevated by exercise.Exercise had synergy effect w ith blocking PI3K in vivo.And exercise could attenuate the inhibitory effect of LY294002.Conclusions:these results suggest that:1)The phosphorylation of m TOR and dow nstream s of m TOR of skeletal m uscle w as inhibited significantly by blocking on PI3K,and attenuated the effect of exercise in vivo.2)D ow nstream s of m TOR w ere all sensitive to exercise,but4EBP1was little sensitive to blocking on PI3K.

PI3K;LY294002;m TOR pathw ay;hypertrophy;exercise

G804.4

A

1004-0560(2010)06-0082-05

2010-11-10;

2010-12-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)30671013)。

曾凡星(1956-),男,教授,主要研究方向?yàn)轶w育運(yùn)動(dòng)中內(nèi)分泌變化及適應(yīng)機(jī)制研究。