王階平，汪家旭，劉凡，潘滄桑

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361005

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因在淡紫擬青霉中的轉(zhuǎn)化

王階平，汪家旭，劉凡，潘滄桑

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361005

為了實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 (egfp) 在生防真菌淡紫擬青霉 9410菌株中的轉(zhuǎn)化，借助中間質(zhì)粒pcDNA3.1(-) 構(gòu)建nptⅡ-egfp融合基因的表達(dá)載體pUPNGT，然后采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將egfp基因轉(zhuǎn)化到淡紫擬青霉9410菌株中。PCR檢測(cè)和Southern blotting分析結(jié)果表明，egfp基因以單拷貝形式整合到淡紫擬青霉9410的基因組中。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子在488 nm光源的激發(fā)下能產(chǎn)生綠色熒光。這些結(jié)果說明egfp基因已成功轉(zhuǎn)化至淡紫擬青霉 9410菌株并獲得表達(dá)。這些工作可為淡紫擬青霉在不同條件下的防效評(píng)價(jià)、環(huán)境安全評(píng)價(jià)等提供新的途徑和方法。

淡紫擬青霉，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，根癌農(nóng)桿菌，遺傳轉(zhuǎn)化

Abstract:The main aim of this study was to transform the enhanced green fluorescent protein gene (egfp) into biocontrol fungusPaecilomyces lilacinusstrain 9410. We constructed the expression vector pUPNGT of the fusion genenptII-egfpusing pcDNA3.1(-)as a helper plasmid. Theegfpgene was then transformed intoP. lilacinusstrain 9410 viaAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation. PCR and Southern blotting analysis showed that theegfpgene was integrated into the genomes of the tested transformants and the integration manner was single-copy. The transformants could generate green fluorescence when they were excited by 488 nm blue laser. These results indicated that theegfpgene had been successfully transformed intoP. lilacinus9410 and expressed in the tested transformants. Our work may provide a new approach to assess environmental safety and practical biocontrol efficacy ofP. lilacinusunder different conditions.

Keywords:Paecilomyces lilacinus, enhanced green fluorescent protein,Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation

淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus(Thom.)Samson 1974是一種土壤及多種植物根際的習(xí)居菌，在全球廣泛分布?，F(xiàn)已認(rèn)為它是最有前途的植物病原線蟲的生防真菌之一，全球已有60多個(gè)國(guó)家開展了應(yīng)用淡紫擬青霉防治根結(jié)線蟲Meloidogynespp.、胞囊線蟲Heteroderaspp.等植物病原線蟲的研究，并已開始付諸實(shí)踐[1-3]。同時(shí)，淡紫擬青霉對(duì)有害昆蟲[4]、動(dòng)物寄生蟲[5]、植物病原菌[6]等也有一定的防控效果。但在淡紫擬青霉的遺傳背景及其控害的作用機(jī)制等方面，至今仍了解甚少。絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，為人們從分子水平了解絲狀真菌的遺傳背景和進(jìn)一步的菌株改造提供了強(qiáng)有力的工具。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法 (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT) 具有易操作、轉(zhuǎn)化受體多樣化、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、T-DNA在真菌基因組中以單拷貝插入為主等優(yōu)點(diǎn)。自1998年de Groot等[7]首次將ATMT法應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化以來，已有大量的絲狀真菌通過ATMT法成功實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化[8-10]。本研究以G418抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，采用ATMT法將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 (Enhanced green fluorescent protein，egfp)[11]整合到生防真菌淡紫擬青霉 9410菌株的基因組中，實(shí)現(xiàn)淡紫擬青霉9410的egfp標(biāo)記，為其在防效評(píng)價(jià)、生態(tài)學(xué)跟蹤研究和環(huán)境安全評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

淡紫擬青霉P. Lilacinus9410菌株，大腸桿菌Escherichia coliDH5α 菌 株 ， pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1-egfp質(zhì)粒由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院寄生動(dòng)物研究室保存；根癌農(nóng)桿菌A. tumefaciensEHA105菌株由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳亮教授提供；真菌表達(dá)載體 pUR5750由 RE Cardoza博士(University of León，Spain) 提供。

1.2 含有egfp基因的二元載體的構(gòu)建

首先按圖1的流程，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切、連接和序列分析等步驟分別將來自構(gòu)巢曲霉Aspergrillusnidulans的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子 PgpdA、G418抗性基因nptⅡ+彈性連接肽 (Linker)、egfp基因和來自構(gòu)巢曲霉A. nidulans的色氨酸合成酶C基因的轉(zhuǎn)錄終止子 TtrpC 4個(gè)片段插入到中間質(zhì)粒pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建成nptⅡ-egfp融合基因的表達(dá)DNA序列組件PgpdA-NPTL-egfp-TtrpC；然后，經(jīng)酶切、連接步驟將該表達(dá)DNA序列組件插入到真菌表達(dá)載體 pUR5750中，構(gòu)建成二元載體 pUR5750-PgpdA-NPTL-egfp-TtrpC，命名為pUPNGT。

圖1 構(gòu)建nptII-egfp融合基因的表達(dá)DNA序列組件的流程圖Fig.1 Construction flow chart of the expression DNA cassette of the fusion genenptII-egfp.

1.3 淡紫擬青霉分生孢子的準(zhǔn)備

用無菌蒸餾水從培養(yǎng)7～10 d的PDA平板上洗下淡紫擬青霉的分生孢子，離心后用MM液體培養(yǎng)基重懸，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后用MM液體培養(yǎng)基將孢子濃度調(diào)整為108個(gè)/mL。

1.4 根癌農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)

表達(dá)載體 pUPNGT采用液氮凍融法直接轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中。從含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基 (含 50 μg/mL卡那霉素)，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。第2天用誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (含50 μg/mL 卡那霉素、40 mmol/L MES (pH 5.3)、0.5% 甘油 (W/V)、200 μmol/L乙酰丁香酮的 MM液體培養(yǎng)基) 稀釋至OD600大約 0.15，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為 0.6～0.8。

1.5 淡紫擬青霉的轉(zhuǎn)化

取已活化好的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液和制備好的淡紫擬青霉分生孢子懸液各 100 μL，加入到1.5 mL EP管中，離心后用200 μL誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，采用液相靜置方式置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行共培養(yǎng)，48 h后將共培養(yǎng)物涂布在含 300 μg/mL G418和300 μg/mL頭孢霉素的PDA平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。

1.6 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)

淡紫擬青霉原始菌株和轉(zhuǎn)化子的基因組 DNA的提取按文獻(xiàn)[12]的方法和步驟進(jìn)行。以基因組DNA為模板，用擴(kuò)增egfp基因的引物eGFPF: 5′-AT AAGAATGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′和 eGFPR: 5′-CCGGAATTCTTACTTGTACAGCT CGTC-3′對(duì)eGFP轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.7 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的Southern blotting分析

選擇質(zhì)粒pUPNGT上無酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，以質(zhì)粒pUPNGT的NotI和EcoR I的酶切片段 (egfp) 為模板制備探針。標(biāo)記、雜交及檢測(cè)的方法和步驟參照試劑盒上 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ，購(gòu)自上海華舜公司) 提供的方法進(jìn)行。

1.8 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡觀察

在潔凈的載玻片中央滴加無菌水，分別從PDA平板上挑取轉(zhuǎn)化子菌絲體于水滴中，用解剖針分散菌絲體，蓋上蓋玻片。于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子的egfp基因的表達(dá)情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1egfp基因表達(dá)載體pUPNGT的構(gòu)建

按圖1的流程，分別將啟動(dòng)子PgpdA、篩選標(biāo)記基因nptII+Linker (即NPTL)、egfp基因和轉(zhuǎn)錄終止子TtrpC 這4個(gè)片段，依次插入到中間質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-PgpdA-NPTL-egfp-TtrpC。然后，用XbaI和Hind III將PgpdA-NPTL-egfp-TtrpC片段切下，插入到真菌表達(dá)載體pUR5750的相應(yīng)位點(diǎn)，得到了表達(dá)載體 pUR5750-PgpdANPTL-egfp-TtrpC，命名為pUPNGT。

2.2 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的獲得與初步鑒定

含載體 pUPNGT的農(nóng)桿菌和淡紫擬青霉的分生孢子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中液相靜置共培養(yǎng)48 h，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布在含300 μg/mL G418和300 μg/mL頭孢霉素的PDA平板上，培養(yǎng)5 d左右即有G418抗性菌落出現(xiàn)，隨機(jī)挑取 G418抗性菌落轉(zhuǎn)接至含有400 μg/mL G418的PDA平板，這些菌落都可以正常生長(zhǎng)。據(jù)此初步認(rèn)定這些抗性菌落為轉(zhuǎn)化子。結(jié)合幾次轉(zhuǎn)化結(jié)果，本研究對(duì)淡紫擬青霉9410的轉(zhuǎn)化率為140～156個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。

2.3 轉(zhuǎn)化子的PCR和Southern blotting分析

從抗性平板 (含400 μg/mL G418) 上隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA后，用擴(kuò)增egfp基因的引物eGFPF和eGFPR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，10個(gè)轉(zhuǎn)化子在約750 bp處均有一條特異的擴(kuò)增條帶，PCR反應(yīng)均為陽(yáng)性，而原始菌株的PCR反應(yīng)則為陰性 (數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果提示，egfp基因已成功整合到各轉(zhuǎn)化子的基因組中。

淡紫擬青霉1、4、18、19號(hào)轉(zhuǎn)化子和原始菌株(陰性對(duì)照) 的基因組 DNA分別用SpeI進(jìn)行單酶切，該酶切位點(diǎn)位于T-DNA外側(cè)，質(zhì)粒pUPNGT (陽(yáng)性對(duì)照) 用Hind III進(jìn)行單酶切，按照試劑盒的方法進(jìn)行egfp基因的Southern雜交和檢測(cè)。結(jié)果表明egfp基因已經(jīng)整合到淡紫擬青霉基因組中，而且都是以單拷貝的方式整合 (圖2)。

2.4 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡觀察

為了檢測(cè)淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的egfp基因的表達(dá)情況，利用熒光顯微鏡觀察各轉(zhuǎn)化子的菌絲體在488 nm藍(lán)色激光光源的激發(fā)下能否產(chǎn)生綠色熒光。圖3所示的是1、4和18號(hào)3個(gè)轉(zhuǎn)化子的菌絲體在藍(lán)色激光激發(fā)下的形態(tài)，轉(zhuǎn)化子eGFP1、4和18在488 nm藍(lán)色激光的激發(fā)下均發(fā)出了綠色熒光。結(jié)果表明，egfp基因在轉(zhuǎn)化子中得到了表達(dá)。

圖2 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的Southern blotting分析Fig.2 Southern blotting analysis of transformants ofPaecilomyces lilacinus. +: positive control (plasmid pUPNGT);?: negative control (genomic DNA ofP. lilacinus9410 original strain); 1–4: genomic DNA of transformant 1,4,18 and 19,respectively.

圖3 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡觀察 (200×)Fig.3 Observations of transformants ofPaecilomyces lilacinususing fluorescent microscope (200×).

2.5 淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性

將淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子接種到不含抗生素 G418的PDA平板上連續(xù)傳代5次，每代培養(yǎng)時(shí)間均為5 d，然后再接種到含有400 μg/mL G418的PDA平板，培養(yǎng)7 d。結(jié)果表明，淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子在沒有抗生素的壓力下連續(xù)傳代 5次后，仍保持了抗高濃度G418 (400 μg/mL) 的能力，而且轉(zhuǎn)化子仍能產(chǎn)生綠色熒光 (數(shù)據(jù)未顯示)，提示淡紫擬青霉菌轉(zhuǎn)化子的G418抗性和egfp基因能穩(wěn)定遺傳。

3 討論

遺傳轉(zhuǎn)化通常是稀有事件，因此，從大量未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的背景中篩選轉(zhuǎn)化子有賴于可供選擇轉(zhuǎn)化子的遺傳標(biāo)記。潮霉素 (HygB) 已廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。但淡紫擬青霉9410菌株對(duì)HygB具有高度的抗性，因此 HygB不能用來篩選該菌株的轉(zhuǎn)化子。后來，我們發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)新霉素類抗生素G418較為敏感，可用于轉(zhuǎn)化子的篩選。文獻(xiàn)資料也表明，G418及其抗性基因nptII已在酵母[13]、須癬毛癬菌Trichophyton mentagrophytes[14]等真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。本室以G418和nptII基因分別為篩選抗生素和篩選標(biāo)記，已成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的淡紫擬青霉9410的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

綠色熒光蛋白 (GFP) 是一類存在于水母、水螅等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的非常穩(wěn)定的生物發(fā)光蛋白質(zhì)。GFP能在細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母、植物、真菌、線蟲、哺乳動(dòng)物等多種異源細(xì)胞中表達(dá)，這一特性使其成為廣泛應(yīng)用的熒光標(biāo)記分子，已在分子醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)和微生物分子生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。盡管GFP已對(duì)許多真菌成功實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記[15]，但對(duì)植物病原線蟲的生防真菌淡紫擬青霉的遺傳標(biāo)記國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法 (ATMT)，成功實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp對(duì)淡紫擬青霉9410的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)egfp基因以單拷貝的方式整合到淡紫擬青霉9410基因組中，egfp基因能穩(wěn)定遺傳，且淡紫擬青霉轉(zhuǎn)化子在 488 nm藍(lán)色激光的激發(fā)下均能發(fā)出綠色熒光。

淡紫擬青霉雖已在全球得到廣泛的研究并已付諸實(shí)踐[1-2]，但淡紫擬青霉菌劑作為以活菌的形式發(fā)揮生防功能的生防制劑，往往存在防效不穩(wěn)定的問題，可能隨著土壤環(huán)境、施用方法、耕作方式、灌溉方式等的不同，其防效可能出現(xiàn)較大差異[16]。要解決這些問題，就必須研究在不同土壤、溫度 (季節(jié))、不同作物栽培方式 (如聚乙烯薄膜覆蓋與露土、滴灌施肥等) 等條件下，淡紫擬青霉在植物根際的定殖能力、發(fā)生、發(fā)展等情況。由于植物根際有著復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在研究目標(biāo)菌株與植物及其他根際微生物相互作用的過程中，如何將它們與根際其他土著微生物區(qū)分開來顯得特別重要，GFP分子標(biāo)記及其熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用為這項(xiàng)工作提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、靈敏和可靠的方法。本研究所進(jìn)行的工作可為淡紫擬青霉在不同條件下的防效評(píng)價(jià)、生態(tài)學(xué)跟蹤研究和環(huán)境安全評(píng)價(jià)等提供新的途徑和方法。

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Transformation of enhanced green fluorescent protein gene inPaecilomyces lilacinusmediated byAgrobacterium tumefaciens

Jieping Wang, Jiaxu Wang, Fan Liu, and Cangsang Pan

School of Life Science,Xiamen University,Xiamen361005,China

Received:October 26, 2009;Accepted:March 16, 2010

Supported by:Key Program of Fujian Province (No. 2008N01050731).

Corresponding author:Cangsang Pan. Tel: +86-592-2186812; Fax: +86-592-6889168; E-mail: cspan@xmu.edu.cn

福建省重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 2008N01050731) 資助。