董小巖，田文洪，袁振華，譚淑萍，吳小兵

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052

2 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司，北京 100176

生物技術(shù)與方法

新型重組AAV5/5載體及包裝系統(tǒng)

董小巖1,2,3*，田文洪1*，袁振華1，譚淑萍1，吳小兵1

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052

2 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司，北京 100176

本研究組建了一種可用于規(guī)模化生產(chǎn)的以重組單純皰疹病毒為輔助病毒的AAV5/5載體包裝系統(tǒng)。首先，將5型腺相關(guān)病毒 (AAV5) 的rep和cap基因插入I型單純皰疹病毒 (HSV-1) 基因組非必需基因UL2中，獲得重組病毒rHSV1-rep5cap5。其次，構(gòu)建一種攜帶AAV5 ITR的通用型載體質(zhì)粒pAAV5neo，將報(bào)告基因EGFP插入pAAV5neo中，得到pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒。將pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入BHK-21細(xì)胞，用G418選擇培養(yǎng)，挑選出表達(dá)EGFP并在重組病毒rHSV1-rep5cap5感染下能高效產(chǎn)生rAAV5/5-EGFP的單克隆載體細(xì)胞株C020。用rHSV1-rep5cap5感染C020細(xì)胞制備rAAV5/5-EGFP，用“氯仿處理-聚乙二醇/氯化鈉-氯仿抽提”方法粗純化rAAV5/5-EGFP。用100 kDa分子量截流超濾方法進(jìn)一步純化和濃縮，獲得高純度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE電泳分析可見(jiàn)3條特征性外殼蛋白帶。電鏡分析顯示病毒顆粒以實(shí)心顆粒為主。用rAAV5/5-EGFP病毒按1×105vg/cell感染體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，可見(jiàn)30%細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。本研究提出了一種高效AAV5/5載體生產(chǎn)系統(tǒng)和純化方法，為重組AAV5載體的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

5型腺相關(guān)病毒 (AAV5)，I型單純皰疹病毒 (HSV1)，病毒載體，包裝系統(tǒng)

Abstract:We developed a scalable AAV5/5 vector packaging system by using replication competent recombinant herpes simplex type 1 virus as helper virus. The fragment containingrepandcapgenes of AAV5 was inserted into the non-necessary gene (UL2) of HSV1 genome, resulting in the helper virus rHSV1-rep5cap5. An AAV5/5 vector pAAV5neo carrying two AAV5 ITRs was constructed by inserting aneogene expression cassette into the plasmid backbone of pAV5CMV-GFP. pAAV5neo-EGFP was constructed by insertingEGFPgene into pAAV5neo. BHK21 cell was transfected with pAAV5neo-EGFP and cultured in the presence of G418. EGFP expression positive monoclonal cells were picked up, and one that produced rAAV5/5-EGFP with thehighest efficiency under the help of rHSV1-rep5cap5 was chosen as the production cell line named as C020. rAAV5/5-EGFP was produced by infecting C020 cells with rHSV1-rep5cap5, and crudely purified by our previous method of ‘chloroform treatment-PEG8000/NaCl precipitation- chloroform extract’. rAAV5/5-EGFP preparation with high purity was obtained by ultrafiltration with molecular weight cut-off value of 100 kDa. SDS-PAGE stained with Coomassie brilliant blue R250showed clearly specific pattern of three bands of AAV capsid proteins. rAAV5/5-EGFP was also assayed using negative stain transmission electron microscopy and the majority of the virus particles were found solid. About 30% green fluorescent cells could be seen after infecting HEK293 cells with rAAV5/5-EGFP 24 h at 1×105vg/cell. In conclusion, we have established an efficient AAV5/5 vector production system and could produce recombinant AAV5/5 virus in large amounts for gene therapy research.

Keywords:Adeno-associated virus type 5 (AAV5), herpes simplex virus I, virus vector, production system

腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 載體在基因治療研究中受到廣泛的關(guān)注。自然界中存在多種血清型的AAV病毒，目前得到公認(rèn)的有8個(gè)型 (AAV 1至5型，以及7至9型)[1]。不同血清型AAV病毒的細(xì)胞親嗜性存在明顯的差異，感染細(xì)胞時(shí)所利用的細(xì)胞受體也不一樣。AAV2的主要受體是硫酸肝素糖蛋白 (HSPG)，ανβ5整合素和 bFGF受體1是其輔助受體。通常認(rèn)為AAV5的主要受體是含有2,3-交聯(lián)唾液酸 (2,3-linked sialic acid) 的糖蛋白[2]，血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子受體 (PDGFR) 可能是AAV5的一種輔助受體[3]。

AAV載體的大量制備是開展其應(yīng)用研究的前提。研究發(fā)現(xiàn)將 AAV2的rep基因和AAV5的cap基因雜合成rep2cap5用于包裝含有 AAV2 ITR(Inverted repeat terminal) 的基因組效率低[4]，可能是因?yàn)锳AV2的rep蛋白不能有效地將帶有AAV2 ITR的單鏈基因組DNA包裝到AAV5的外殼中去。為了避免AAV5與AAV2 ITR之間可能存在的“不匹配”問(wèn)題，本研究擬構(gòu)建一種用攜帶 AAV5自身 ITR(ITR5) 的通用型載體 pAAV5neo，以及攜帶 AAV5repcap基因的重組單純皰疹病毒 HSV1-rep5cap5，組建成rAAV5/5載體的包裝系統(tǒng)，為AAV5/5載體研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞株

pAV5-Trans質(zhì)粒和pAV5CMV-GFP質(zhì)粒由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所舒躍龍博士惠贈(zèng)。pAV5-Trans中攜帶了AAV5的rep和cap基因編碼區(qū)，長(zhǎng)度約4.3 kb，用XbaI可將其從質(zhì)粒上完整切出。pAV5CMV-GFP含有 AAV5的兩個(gè)反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列 (ITR5)，兩個(gè) ITR5之間為 CMV-GFPSV40 poly A表達(dá)盒。pAAV2neo為病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存。pSV2neo為病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。攜帶重組 HSV1病毒基因組的5個(gè)粘粒Cos6、Cos28、Cos14、Cos56和Cos48由英國(guó)Glascow大學(xué)的A.J. Davison[5]惠贈(zèng)。這些粘粒的骨架是Supercos MW，分別攜帶了HSV1(17株)病毒的基因組的長(zhǎng)約40 kb的HSV1基因組片段，這些片段的末端序列相互重疊，覆蓋了全長(zhǎng)的HSV1基因組 (152 kb)。Max Efficiency DH5α感受態(tài)菌購(gòu)自Invitrogen公司。BHK21及HEK293細(xì)胞為病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM為Invitrogen公司產(chǎn)品。磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑為北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司產(chǎn)品。T載體試劑盒購(gòu)自 Promega公司。PacI酶為NEB公司產(chǎn)品，其他內(nèi)切酶、修飾酶以及高保真Taq酶 (PyroBestTaq) 均為 TaKaRa公司產(chǎn)品。地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒為 Boehringer Mannheim公司的產(chǎn)品。胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。細(xì)胞培養(yǎng)用低熔點(diǎn)瓊脂糖 SeaPlaque Agarose購(gòu)自Lonza公司。BM2000 DNA Marker購(gòu)自Biomed公司。λ/Hind III DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建

重組粘粒Cos6-rep5cap5的構(gòu)建步驟：用XbaI酶切pAV5-Trans，回收約4.3 kb的rep5cap5基因片段，將該片段插入到粘粒Cos6的XbaI位點(diǎn)中，得到重組粘粒Cos6-rep5cap5。

pAAV5neo的構(gòu)建步驟：通過(guò)酶切補(bǔ)平再連接的方法消除掉 pSV2neo中的Hind III位點(diǎn)，成為pSV2neo-1。用PCR方法擴(kuò)增質(zhì)粒pSV2neo-1中的neo基因表達(dá)盒：上游引物序列為：5′-CTGCAAG CTT TGGGCGAAGAACTCCAGCAT-3′，下游引物序列為 5′-GCCAAAGCTT ACGTGACTGGGTCATGGC TG-3′，兩條引物均在5′端引入了Hind III酶切位點(diǎn)，用下劃線標(biāo)出。PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)約1.8 kb的產(chǎn)物，經(jīng)Hind III酶切后插入到質(zhì)粒pAV5CMV-GFP的骨架上Hind III位點(diǎn)中，得到載體質(zhì)粒 pAV5CMVGFPneo。合成引物 5′-TTAGGATCC ATAGAGCCC ACCGCATCC-3′及 5′-GTTGGATCC CTCGAGGA GCTTGCCATT-3′，下劃線標(biāo)記處為BamH I酶切位點(diǎn)。用 PCR方法擴(kuò)增 pAAV2neo質(zhì)粒中的CMV-MCS-bGH polyA片段，經(jīng)BamH I酶切后插入pAV5CMV-GFPneo中的BamH I位點(diǎn)中 (替代原來(lái)的 CMV-GFP-SV40 polyA)，得到 pAAV5neo。用 PCR方法將EGFP基因插入pAAV5neo的KpnI和SalI位點(diǎn)之間，構(gòu)建成pAAV5neo-EGFP。

1.2.2重組輔助病毒rHSV1-rep5cap5的產(chǎn)生和鑒定

為獲得攜帶AAV5rep和cap基因的重組HSV1病毒rHSV1- AAVrep5cap5，將Cos6-AAVrep5cap5、Cos28、Cos14、Cos56和Cos48各取2 μg混合，分別用1 μLPacI酶切過(guò)夜。酶切反應(yīng)液分別2.5倍體積的無(wú)水乙醇，?70℃放置 30 min后，于 4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清，得到的DNA沉淀用10 μL無(wú)菌TE溶液溶解，以備轉(zhuǎn)染用。

在60 mm培養(yǎng)皿中接種2×106個(gè)HEK 293細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染前 4～6 h換新鮮培養(yǎng)液 (含 10%FBS的DMEM)。在無(wú)菌的1.5 mL的Eppendorf管加入上述酶切處理后回收的DNA各 10 μL，加入無(wú)菌超純水 125 μL，混勻。后加入2.5 mol/L CaCl215 μL，用渦旋器充分混勻；再沿管壁加入 2×HBS 150 μL，輕輕混勻，室溫下靜置5 min，加入60 mm平皿的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液中，小心混勻。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日換成新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。之后每2～3 d換液1次，直到出現(xiàn)CPE (細(xì)胞變大變圓現(xiàn)象) 。收取病變細(xì)胞及上清在?70℃和37℃反復(fù)凍融3次，4 000 r/min、4℃離心 15 min，取上清作為重組輔助病毒 rHSV1-rep5cap5的原始毒種。

將原始毒種進(jìn)行系列稀釋后感染 6孔板中的BHK21細(xì)胞，用含有 0.5%的低溶點(diǎn)瓊脂糖(SeaPlaque Agarose，Lonza公司)的完全培養(yǎng)液覆蓋，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。3 d后隨機(jī)挑取彼此分離良好的單噬斑病毒分別擴(kuò)增備用。

設(shè)計(jì)針對(duì) AAV5cap基因的特異引物對(duì)用于rHSV1-rep5cap5的篩選鑒定。上游引物cap5F序列為 5′-ACGTACAACCTCCAGGAAAT-3′，下游引物cap5R 序列為 5′-TCTCTGGGTTCCA CCTCTTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)310 bp。為了鑒定rHSV1-rep5cap5病毒基因組中rep5cap5片段的插入方向，在插入位點(diǎn)(UL2基因的XbaI位點(diǎn)) 附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物：HSV1 UL2 up 5′-ACCCTGACCGTCAAGCGCGG-3′；HSV1 UL2 down 5′-CGGATAACTCCGCCCACGAA-3′。將cap5F引物分別與HSV1 UL2 up和HSV1 UL2 down引物配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取50 μL rHSV1-rep5cap5病毒液煮沸10 min作為PCR反應(yīng)的樣品DNA模板。

1.2.3AAV5/5-EGFP載體細(xì)胞株的建立和篩選

取純化的pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒DNA按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說(shuō)明書中的操作方法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4～6 h換成含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液；24 h后換成含800 μg/mL G418的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，之后每2 d換液1次，抗性細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至融合時(shí)消化傳代，至15 d后撤去培養(yǎng)液中的 G418繼續(xù)培養(yǎng)并凍存，命名為 BHK21/pAAV5neo-EGFP細(xì)胞。

將BHK21/pAAV5neo-EGFP細(xì)胞消化后接種約1×104于6孔板的1孔中，按10倍比連續(xù)稀釋至其余5孔，培養(yǎng)2～3 d后換成含0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM/2% FBS液鋪板培養(yǎng)1～2 d，在熒光顯微鏡下標(biāo)記發(fā)綠色熒光的細(xì)胞克隆，挑取分離良好的單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)及凍存。用重組輔助病毒rHSV1-rep5cap5感染各單克隆細(xì)胞株測(cè)試其包裝AAV病毒的效果，選擇包裝效率最高的單克隆細(xì)胞株作為rAAV5/5-EGFP的生產(chǎn)細(xì)胞。

1.2.4rAAV5/5-EGFP的大量制備和純化

將1.2.3中挑選出的rAAV5/5-EGFP的生產(chǎn)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至5個(gè)轉(zhuǎn)瓶 (220 mm×10 cm)，用空斑純化后的重組輔助病毒 rHSV1-rep5cap5 以 moi(Multiplicity of infection)=1～5感染細(xì)胞，72 h后，收集上清和病變細(xì)胞，1 200×g離心15 min收集病變細(xì)胞 (棄去上清)，用PBS液重懸細(xì)胞沉淀，?70℃與 37℃之間反復(fù)凍融 3次。按吳小兵等[6]發(fā)表的方法進(jìn)行粗純化。將粗純的rAAV5/5-EGFP樣品用100 kDa切向流膜包 (millipore公司) 進(jìn)行超濾，用PBS液置換液體，最后濃縮至約5 mL，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，分裝于?70℃條件下保存。用地高辛標(biāo)記的 CMV探針點(diǎn)雜交方法測(cè)定病毒滴度(Viral genomes/mL，vg/mL)。

1.2.5電鏡分析

將純化后的 rAAV5/5-EGFP病毒用 2%鎢酸鹽負(fù)染后，置透射電子顯微鏡下，觀察病毒形態(tài)和空殼率，并拍照。

1.2.6SDS-PAGE分析

將純化的 rAAV5/5-EGFP病毒用 10% SDSPAGE電泳分析純度。用本課題組以前制備的rAAV2/2-EGFP及rAAV2/1-EGFP病毒作為對(duì)照?？捡R斯亮蘭R250染色。

1.2.7rAAV5/5-EGFP病毒感染性檢測(cè)

將 HEK293細(xì)胞按 1×105cell/孔的細(xì)胞量接種到6孔 (24孔板) 中。培養(yǎng)過(guò)夜后，按1×105vg/cell加入rAAV5/5-EGFP病毒，對(duì)照孔加等量rAAV2/2-EGFP病毒。24 h后置倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 AAV5質(zhì)粒載體

構(gòu)建的通用型 AAV5/5載體質(zhì)粒 pAAV5neo和攜帶EGFP的AAV5載體質(zhì)粒pAAV5neo-EGFP結(jié)構(gòu)如圖1所示。pAAV5neo質(zhì)粒攜帶了AAV5病毒的2個(gè)ITR(ITR5)，CMV立早啟動(dòng)子 (Pcmv)、可供外源基因插入的KpnI和SalI位點(diǎn)、牛生長(zhǎng)激素基因的多聚腺苷酸加尾信號(hào) (bGH polyA)，質(zhì)粒骨架上含有氨芐青霉素抗性基因 (Ampr) 和neo基因表達(dá)單位 (neo)。將EGFP基因插入pAAV5neo的KpnI和SalI位點(diǎn)間得到pAAV5neo-EGFP。

2.2 輔助病毒rHSV1-rep5cap5的產(chǎn)生

將 AAV5repcap基因片段插入到粘粒 Cos6的XbaI位點(diǎn)中，得到了重組粘粒 Cos6-rep5cap5。酶切鑒定結(jié)果 (圖2B) 顯示，用XbaI酶切可以切出2條帶，包括約4.3 kb的rep5cap5片段和一條更大的DNA片段 (cos6)。

將 Cos6-AAVrep5cap5、Cos28、Cos14、Cos56和Cos48用PacI線性化后共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得了重組單純皰疹病毒 rHSV1-rep5cap5，其基因組結(jié)構(gòu)如圖 2A所示。用 PCR方法鑒定空斑純化后的rHSV1-rep5cap5 (圖2C)，可見(jiàn)用AAV5cap引物對(duì)可以擴(kuò)增出一條位于 250～500 bp之間的特異條帶(泳道1)，與預(yù)期的310 bp擴(kuò)增片段相符；用AAV5cap上游引物與UL2上游引物未擴(kuò)增出條帶 (泳道3)，而用AAV5cap上游引物與UL2下游引物可擴(kuò)出約500 bp的條帶 (泳道4)，說(shuō)明rep5cap5是正向插入U(xiǎn)L2基因中的。

圖1 pAAV5neo及pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of pAAV5neo and pAAV5neo-EGFP.

圖2 重組輔助病毒rHSV1-rep5cap5的產(chǎn)生和鑒定Fig.2 Generation and identification of rHSV1-rep5cap5. (A) Map of rHSV1-rep5cap5 genome structure. (B) Cos6-rep5cap5 digested byXbaI. 1: λ/Hind III DNA marker; 2, 3: cos6- rep5cap5 digested byXbaI; 4: cos 6. (C) Identification of rHSV1-rep5cap5 by PCR. 1: BM2000 DNA marker; 2: PCR with primers cap5F and cap5R; 3: PCR with primers cap5F and UL2 up; 4: PCR with primers cap5F and UL2 down.

2.3 rAAV5/5-EGFP生產(chǎn)細(xì)胞株的獲得

將pAAV5neo-EGFP轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞中，用含800 mg/L G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，獲得混合克隆的載體細(xì)胞株 BHK21/pAAV5neo-EGFP。挑取表達(dá)綠色熒光蛋白的單克隆細(xì)胞株12株，并用重組輔助病毒rHSV1-rep5cap5測(cè)試其AAV病毒包裝功能，選出一株包裝效果最好的單克隆細(xì)胞株C020作為rAAV5/5的生產(chǎn)細(xì)胞株 (圖3)。結(jié)果可見(jiàn)C020細(xì)胞幾乎100%表達(dá)綠色熒光蛋白。

2.4 純化后的rAAV5/5-EGFP的SDS-PAGE分析

AAV5的衣殼由3種蛋白質(zhì)組成，即VP1、VP2、VP3，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳時(shí)，可以見(jiàn)到二細(xì)一粗的3條特征性條帶。將純化后的rAAV5/ 5-EGFP病毒進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖4所示，VP1、VP2、VP3這3種蛋白的條帶十分清晰，由雜蛋白產(chǎn)生的條帶基本不可見(jiàn)，經(jīng)凝膠掃描圖像分析，雜蛋白含量少于5%，且與rAAV1/2-EGFP (圖4，泳道3) 和rAAV2/2-EGFP (圖4，泳道2) 相比，帶型有一定的差別。

2.5 純化后的rAAV5/5-EGFP的電鏡分析

將純化后的rAAV5/5-EGFP經(jīng)鎢酸鹽負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察并照相 (圖 5)。從圖中可見(jiàn)，rAAV5/5-EGFP病毒粒子清晰可見(jiàn)，其中有少量的空殼。

圖3 rAAV5/5-EGFP的生產(chǎn)細(xì)胞株C020Fig.3 Production cells C020 for rAAV5/5-EGFP. (A) C020 cells under visible light. (B) C020 cells under UV light.

圖4 rAAV5/5-EGFP、rAAV2/2-EGFP和rAAV2/1-EGFP病毒樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE with coomassie bright blue stain for rAAVs. M: protein molecular marker; 1: rAAV5/5-EGFP; 2:rAAV2/2-EGFP; 3: rAAV2/1-EGFP.

2.6 rAAV5/5-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

為了檢測(cè) rAAV5/5-EGFP的感染性，用每細(xì)胞1×105vg rAAV5/5-EGFP病毒感染培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，等量的rAAV2/2-EGFP病毒作為對(duì)照。24 h在熒光顯微鏡下照相結(jié)果見(jiàn)圖 6?？梢?jiàn)感染 rAAV5/5-EGFP的HEK293細(xì)胞約30%綠色熒光陽(yáng)性，且熒光強(qiáng)度較弱；而感染 rAAV2/2-EGFP的對(duì)照細(xì)胞幾乎100%陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。

圖5 rAAV5/5-EGFP病毒的透射電鏡圖 (52 000×)Fig.5 Transmission electron microscopy of rAAV5/5-EGFP(52 000×).

圖6 rAAV5/5-EGFP及rAAV2/2-EGFP感染HEK293細(xì)胞Fig.6 Infection of HEK293 cells by rAAV5/5-EGFP and rAAV2/2-EGFP. A: 293 cells infected by rAAV5/5-EGFP with 1×105vg/cell, 24 h; B: HEK293 cells infected by rAAV2/2-EGFP with 1×105vg/cell, 24 h.

3 討論

AAV病毒載體因具有廣泛的細(xì)胞和組織嗜性、轉(zhuǎn)染效率高、安全性好、免疫原性較低等優(yōu)點(diǎn)而在基因治療中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。近年來(lái)多種血清型的 AAV載體 (AAV1～11) 的發(fā)展使得 AAV載體的應(yīng)用有了更多的選擇[7]。不同血清型的AAV載體具有明顯不同的組織細(xì)胞嗜性。目前，除了 AAV2載體之外，受到廣泛關(guān)注的還有 AAV1、AAV5、AAV8、AAV9等載體。AAV1載體在肌肉組織高表達(dá)，AAV8載體在肝臟、肌肉組織中高表達(dá)；AAV5載體在呼吸道上皮、視網(wǎng)膜、神經(jīng)組織中高表達(dá)；AAV9載體在心肌組織中高表達(dá)；而 AAV2載體在各種組織的表達(dá)相對(duì)其他 AAV載體來(lái)說(shuō)都是中等水平[1]。

最早建立起來(lái)的AAV載體系統(tǒng)是基于AAV2病毒的。載體質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)將外源基因表達(dá)單位插入兩個(gè)AAV2 ITR之間，在AAV2repcap質(zhì)粒及輔助病毒 (腺病毒或皰疹病毒) 或輔助質(zhì)粒 (如攜帶了腺病毒E2A、E4ORF6、VA RNA的pHelper質(zhì)粒) 存在下包裝成重組AAV2病毒。目前國(guó)際上包裝其他血清型AAV病毒載體通常采用交叉包裝的方式[4]，即用雜合的rep2cap(n)質(zhì)粒 (n代表相應(yīng)的血清型) 替代AAV2repcap質(zhì)粒包裝攜帶了AAV2 ITR的病毒，形成重組AAV2/(n) 病毒。

AAV5與其他血清型AAV在基因組序列水平上的差異較大。AAV5與AAV2的rep基因的同源性僅為67%，而AAV2、AAV3和AAV6之間的rep基因同源性約為90%左右。AAV5的ITR與AAV2的ITR之間的同源性只有58%，遠(yuǎn)比AAV2與AAV3、AAV6之間的 ITR的同源性要低[8]。研究發(fā)現(xiàn)在包裝重組AAV2/5時(shí)包裝效率較低[4]。可能是因?yàn)锳AV2的rep蛋白不能有效地將帶有 AAV2 ITR的單鏈基因組DNA 包裝到AAV5的外殼中去。

Xiao等[8]提出的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)AAV載體至今仍是國(guó)際上AAV載體制備的主要方法。該系統(tǒng)的特色在于用攜帶了5型腺病毒的E2A、E4 ORF6和VA RNA基因的輔助質(zhì)粒代替腺病毒作為輔助病毒的功能，將該質(zhì)粒與AAV載體質(zhì)粒、repcap助手質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，即可包裝出重組AAV載體病毒。與傳統(tǒng)方法相比，其主要優(yōu)越性在于生產(chǎn)系統(tǒng)中無(wú)需輔助病毒，因此稱為無(wú)輔助病毒的AAV包裝系統(tǒng) (Helper free AAV packaging system)。然而，這個(gè)系統(tǒng)依賴于轉(zhuǎn)染，需要大量制備高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA等不足之處，更為不利的是，用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝系統(tǒng)生產(chǎn)的AAV病毒含有較多的空殼病毒，需要用超速離心方法去除。

本課題組曾用“一種病毒感染一個(gè)載體細(xì)胞株”的策略建立了一種高效制備AAV2/2載體的方法[9]，并在基因治療研究中得到廣泛應(yīng)用。隨后本課題組用同樣的策略成功地建立了 AAV2/1載體包裝系統(tǒng)并用于基因治療研究[10-11]。這種生產(chǎn)策略具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需轉(zhuǎn)染細(xì)胞、可以大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。本研究擬用類似的策略組建一種rAAV5/5病毒的包裝系統(tǒng)。

本研究構(gòu)建了通用型的AAV5載體pAAV5neo，其中攜帶了2個(gè)AAV5的ITR (172 bp，比AAV2 ITR 145 bp稍長(zhǎng))。兩個(gè)AAV5 ITR 之間是CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和牛生長(zhǎng)激素基因polyA加尾信號(hào)。在質(zhì)粒骨架上插入了neo基因表達(dá)單位，用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 AAV5載體細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了pAAV5neo-EGFP，用于測(cè)試該載體的功能。同時(shí)，本研究利用攜帶 HSV1 (17 strain) 的一套粘粒(setC，包含 cos6、cos14、cos28、cos48、cos56) 獲得了重組單純皰疹病毒 rHSV1-rep5cap5，并進(jìn)行空斑純化，作為包裝AAV5/5載體的輔助病毒。

為了測(cè)試該包裝系統(tǒng)的功能，本研究用pAAV5neo-EGFP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用G418選擇培養(yǎng)，并挑選出單克隆細(xì)胞株 C020作為生產(chǎn)rAAV5/5-EGFP的生產(chǎn)細(xì)胞。用 HSV1-AAV5repcap感染C020細(xì)胞株，72 h后收獲上清和細(xì)胞，用本課題組建立的“氯仿處理-聚乙二醇/氯化鈉-氯仿抽提”方法[6]進(jìn)行粗純化，之后用100 kDa分子量截流超濾方法進(jìn)一步純化和濃縮。從SDS-PAGE分析結(jié)果看，rAAV5/5-EGFP病毒顯示出清晰的 3條外殼蛋白條帶 (從大到小為 VP1、VP2、VP3)，未見(jiàn)其他雜蛋白帶。與對(duì)照的 rAAV2/2-EGFP和 rAAV2/1-EGFP病毒相比，3條外殼蛋白帶之間的相對(duì)距離略有差別。電鏡分析結(jié)果表明 rAAV5/5-EGFP病毒顆粒完整，以實(shí)心顆粒為主。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，rAAV5/5-EGFP病毒可以有效感染 HEK293細(xì)胞。然而與相同量的 rAAV2/2-EGFP病毒相比，rAAV5/5-EGFP病毒的感染效率和細(xì)胞表達(dá)EGFP的水平都不如rAAV2/2-EGFP。這個(gè)結(jié)果與 Klein等[12]的報(bào)道是一致的。他們的研究認(rèn)為不同血清型AAV載體介導(dǎo)EGFP基因體外感染HEK293細(xì)胞的表達(dá)水平依次是AAV2 >>AAV1 >>AAV8 >AAV5。然而，值得注意的是，AAV載體的體外感染實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果往往是不一致的[13]，因此不能依據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇體內(nèi)應(yīng)用的AAV載體血清型。

本研究表明，“一株載體細(xì)胞/一株輔助病毒”策略及“氯仿處理-聚乙二醇/氯化鈉-氯仿抽提”粗純化方法[6]同樣適合于制備 rAAV5/5病毒。在此基礎(chǔ)上，用100 kDa分子量截流超濾方法可以進(jìn)一步純化AAV病毒并置換緩沖液。

Wustner等也曾報(bào)道過(guò)用攜帶AAV5rep和cap基因的重組 HSV1病毒來(lái)包裝AAV5/5載體[14]。本研究與其不同之處是本研究采用了 BHK-21細(xì)胞而不是HEK293細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞；本研究的rep5cap5插入 HSV1基因組中的位置是UL2基因，獲得的rHSV1-rep5cap5是復(fù)制型的，而他們的rep5cap5是插入 HSV1 TK中，并且是復(fù)制缺陷的 (缺失了ICP27基因)；他們采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒加輔助病毒感染的方式制備 AAV5/5病毒，而本研究采用輔助病毒感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體細(xì)胞的方式。他們的研究結(jié)果表明其生產(chǎn)系統(tǒng)的包裝效率受到輔助病毒引起生產(chǎn)細(xì)胞 (HEK293細(xì)胞) 產(chǎn)生病變的限制。本研究未發(fā)現(xiàn) AAV5/5載體包裝效率低的問(wèn)題，下一步擬對(duì) AAV5/5載體的包裝效率做更深入的研究?？傊狙芯拷⒌膔AAV5/5載體包裝系統(tǒng)和純化方法為下一步開展rAAV5/5的規(guī)模化制備和應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。

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A novel packaging system of recombinant AAV5/5 vector

Xiaoyan Dong1,2,3*, Wenhong Tian1*, Zhenhua Yuan1, Shuping Tan1, and Xiaobing Wu1

1State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering,Institute for Viral Disease Prevention and Control,Chinese Center for Disease Prevention and Control,Beijing100052,China
2State Key Laboratory of Genetic Engineering,Institute of Genetics,School of Life Science,Fudan University,Shanghai200433,China
3Beijing Fiveplus Molecular Medicine Institute,Beijing100176,China

Received:January 3, 2010;Accepted:March 4, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021202), Autonomous Research Program of State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering (No. 2008-s-0008).

Corresponding author:Xiaobing Wu. Tel: +86-10-63523187; Fax: +86-10-63532053; E-mail: wuxb0168@vip.sina.com

*These authors contributed equally to this study.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA021202)，病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題 (No. 2008-s-0008) 資助。