日本血吸蟲蛋白酶體α2亞基基因的克隆、表達(dá)及功能分析

洪煬，韓宏曉，彭金彪，李曄，石耀軍，傅志強(qiáng)，劉金明，李祥瑞，林矯矯

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

日本血吸蟲蛋白酶體α2亞基基因的克隆、表達(dá)及功能分析

洪煬1,2，韓宏曉1,2，彭金彪1，李曄1，石耀軍1，傅志強(qiáng)1，劉金明1，李祥瑞2，林矯矯1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

26S蛋白酶體是一種能夠降解大多數(shù)內(nèi)源性蛋白的多亞基復(fù)合物，它的蛋白降解作用能夠影響細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄控制和其他一些重要的細(xì)胞進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)利用 PCR技術(shù)從日本血吸蟲 18 d童蟲中首次擴(kuò)增到蛋白酶體 α2亞基基因(GenBank Accession No.AY813725)，序列分析表明該基因的開放閱讀框(ORF)含708 bp，編碼235個(gè)氨基酸，理論分子量25.84 kDa。同源性分析結(jié)果顯示，該基因?yàn)槿毡狙x蛋白酶體α2亞基，命名為SjPSMA2。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示該基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d蟲體中都有表達(dá)，7 d和23 d蟲體表達(dá)量低于其他幾個(gè)時(shí)期。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a(+)-SjPSMA2，在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá)，重組蛋白以包涵體形式存在，Western blotting顯示表達(dá)產(chǎn)物能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識別，并且能檢測到天然狀態(tài)下該蛋白的存在。應(yīng)用重組蛋白免疫 BALB/c小鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平及12.33%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率。SjPSMA2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的獲得，為探索蛋白酶體在血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供了重要基礎(chǔ)。

日本血吸蟲；蛋白酶體α2亞基；克?。槐磉_(dá)；免疫保護(hù)

Abstract:The 26S proteasome is a proteolytic complex responsible for the degradation of the vast majority of eukaryotic proteins.Regulated proteolysis by the proteasome is thought to influence cell cycle progression, transcriptional control, and other critical cellular processes.A novelSchistosoma japonicumgene(GenBank Accession No.AY813725)proteasome α2 subunit(SjPSMA2)was cloned.Sequence analysis revealed that the ORF ofSjPSMA2gene contains 708 nucleotides encoding 235 aminoacids, and the molecular weight was estimated to be 25.84 kDa.Real-time PCR analysis showed that this gene expressed in 7 d, 13 d,18 d, 23 d, 32 d and 42 d schistosoma.The mRNA level ofSjPSMA2was lower in 7 d and 23 d schistosomulum than that in other stages.TheSjPSMA2cDNA fragment was subcloned into an expression vector pET28a(+)and transformed intoE.coliBL21(DE3)cells.After induction with IPTG, the 30 kDa fusion protein was produced as included bodies.Western-blotting revealed that the fusion protein could be recognized by the rabbit serum anti-Schistosoma japonicumadult worm antigen preparation, and the protein in native could be detected.After immunization of BALB/c mice with the fusion protein, the reduction rates of worm counts and liver egg counts were 12.33% and 35.23%.ELISA results revealed that the vaccinated group showed a significant increase in the level of IgG antibody.This study provided an important basis for investigating the regulation mechanism of the proteasome during the development ofSchistosoma japonnicum.

Keywords:Schistosoma japonicum, proteasome α2 subunit(PSMA2), clone, expression, immunoprotection

血吸蟲病(Schistosomiasis)是由血吸蟲(Schistosome)感染引起的一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。全球有76個(gè)國家和地區(qū)流行血吸蟲病，有5～6億人受到威脅，約2億人感染血吸蟲病[1]。

我國血吸蟲病的防治雖然已經(jīng)取得了巨大成就，但是全面控制血吸蟲病傳播的前景仍不容樂觀。吡喹酮自問世以來，以其高效、低毒、使用方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)在血吸蟲病臨床治療和防治工作中得到廣泛應(yīng)用，并成為目前治療血吸蟲病的唯一藥物，20多年來，未見有新的治療血吸蟲病的藥物出現(xiàn)[2]。然而，近年來曼氏血吸蟲已經(jīng)有吡喹酮抗性蟲株的報(bào)道[3]，耐藥蟲株的出現(xiàn)引起了人們的不安與高度關(guān)注。因此，加強(qiáng)抗血吸蟲高效疫苗的開發(fā)和新藥物靶標(biāo)的篩選顯得格外重要。

血吸蟲童蟲是在宿主體內(nèi)發(fā)育早期階段的蟲體，也是蟲體發(fā)育的關(guān)鍵階段，蟲體比較脆弱，容易受到外界影響和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。血吸蟲在終宿主體內(nèi)從尾蚴發(fā)育到成蟲，在形態(tài)和生理上都發(fā)生了很大的變化，這些變化的實(shí)現(xiàn)是以蛋白合成、降解途徑的正常進(jìn)行為基礎(chǔ)的。假如在童蟲階段對血吸蟲的蛋白降解途徑進(jìn)行人為干預(yù)，則有可能使血吸蟲在宿主體內(nèi)的蛋白降解途徑受阻，繼而對血吸蟲之后的生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響，對控制血吸蟲病有著重要的意義，同時(shí)也可為抗血吸蟲疫苗和潛在藥物靶標(biāo)的研究提供基礎(chǔ)。

近幾年，有個(gè)別學(xué)者對曼氏血吸蟲蛋白酶體進(jìn)行了研究[4-6]，并認(rèn)為它在曼氏血吸蟲的生長發(fā)育中具有重要作用。但對日本血吸蟲蛋白酶體α2亞基基因的研究國內(nèi)外尚未有報(bào)道，對其在日本血吸蟲發(fā)育和生存中的作用還是了解甚少。本研究室在前期構(gòu)建的7 d童蟲消減cDNA文庫中，獲得了一個(gè)EST序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析命名為日本血吸蟲蛋白酶體α2亞基基因(SjPSMA2)，本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)首次克隆到編碼日本血吸蟲蛋白酶體 α2亞基含ORF的cDNA序列，分析了該基因在日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體中的表達(dá)情況，應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了該基因，測定了表達(dá)產(chǎn)物的抗原性并在BALB/c小鼠中進(jìn)行了動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶

Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Invitrogen公司；Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、SalⅠ、SYBR GreenⅠ、EASY Dilution購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；Ni-NTA HisBind Resin(Merck-Novagen)購自中科新生命生物科技有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自天根生化科技(北京)有限公司；硝酸纖維素膜(Whatman)購自經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP購自上海鼎國生物工程公司。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、寄生蟲及血清

pET-28a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠(雄性，20～25 g)、新西蘭白兔(雄性，2.5～3 kg)購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集

新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染 20 000、8000、5000、2000條血吸蟲尾蚴，在感染后 7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取

取液氮中凍存的7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d日本血吸蟲各200 mg，按Trizol試劑盒說明書分別進(jìn)行總RNA的提取。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和含ORF cDNA片段的擴(kuò)增

首先從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的7 d童蟲消減cDNA文庫中，獲得一個(gè)EST序列，以此序列為詢問序列，在日本血吸蟲EST庫中搜索到1個(gè)日本血吸蟲的相應(yīng)EST片段(GenBank Acession No.AY813725)。根據(jù)該 EST序列設(shè)計(jì)特異引物，應(yīng)用 PCR技術(shù)進(jìn)行cDNA片段的擴(kuò)增。上游引物FP：5′-ATGGATCC AT GAGCGAACGGTA-3′(下劃線處為 BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物 RP：5′-GCGTCGACTTATGGTATAG CTG-3′(下劃線處為SalⅠ酶切位點(diǎn))，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。取1 μL反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 10 min；然后 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，純化后亞克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pMD19-T-SjPSMA2，并送英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

將測序得到的cDNA在NCBI上進(jìn)行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用DNAStar軟件分析確定基因的讀碼框，并對氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mr)、理論等電點(diǎn)等參數(shù)進(jìn)行分析。利用 ProtScale軟件(www.expasy.ch/tools/pscale)進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性分析。利用Clustalw軟件對不同物種 PSMA2蛋白進(jìn)行多重比對?？乖奈稽c(diǎn)分析利用 DNAMAN軟件，蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測利用 DAS軟件(http://www.sbc.su.se/miklos/DAS/)，信號肽預(yù)測利用SignalP軟件(www.cbs.dtu/services/Singnalp)。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

選擇血吸蟲持家基因18S rRNA為內(nèi)參[7]。將提取的 7 d、13 d、18 d、23 d、32 d及 42 d蟲體總 RNA，去除基因組 DNA后利用隨機(jī)引物合成 cDNA第一鏈。SjPSMA2熒光定量 PCR 引物：FP：5′-CAGTCTG GTGGTGTTCGG-3′，RP：5′-GTCCTAATGCAGTAG CTTTCC-3′，擴(kuò)增SjPSMA2基因片段長度為133 bp；18S rRNA熒光定量PCR引物FP：5′-GCAAACTGTT TCATCACCG-3′，F(xiàn)P：5′-CAATCCAACGACCTCACT AA-3′，片段擴(kuò)增長度172 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。采用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系包括：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.4 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，模板 cDNA 1.0 μL，共 20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 10 s；95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，其中72℃ 15 s結(jié)束時(shí)間為熒光信號檢測點(diǎn)。每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)。采用Corbett Research公司Rotor-Gene軟件進(jìn)行計(jì)算分析，以 18S rRNA為內(nèi)參標(biāo)化反應(yīng)結(jié)果，得出相對于每百萬持家基因的目的基因含量。

1.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)SjPSMA2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，在其擴(kuò)增序列的5′端和3′端分別引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，通過 PCR擴(kuò)增得到含完整 ORF的SjPSMA2基因序列，將該序列定向克隆于原核表達(dá)載體 pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA2，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21。

1.2.7 pET28a(+)-SjPSMA2在大腸桿菌中的表達(dá)

將鑒定好的 pET28a(+)-SjPSMA2/BL21接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，OD600為 0.6時(shí)加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間和相關(guān)的表達(dá)條件。在判定其表達(dá)狀況后，將以包涵體形式存在的重組蛋白溶解于8 mol/L尿素，以Ni-NTA HisBind Resin純化，隨后以含6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L尿素的PBS及PBS逐步透析，完成復(fù)性。

1.2.8 Western blotting檢測

將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用經(jīng)pET28a(+)/BL21大腸桿菌蛋白吸附的日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清和免疫的 BALB/c小鼠血清作一抗，分別用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG為二抗，TMB作為底物進(jìn)行顯色。

將42 d日本血吸蟲蟲體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用免疫的 BALB/c小鼠血清作一抗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，TMB作為底物進(jìn)行顯色。

1.2.9 ELISA檢測免疫小鼠血清抗SjPSMA2重組蛋白特異性IgG抗體水平

將 30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為SjPSMA2+206佐劑組、206佐劑組、PBS組，每組10只，重組蛋白SjPSMA2的注射劑量為每次每鼠20 μg，共免疫3次，每次間隔20 d。各免疫組小鼠分別在免疫前1周和每次免疫后2周采血，使用間接ELISA方法檢測抗體水平。

1.2.10 小鼠減蟲率和減卵率計(jì)算

末次免疫 2周后，每只小鼠用腹部蓋玻片法感染尾蚴(30±1)條。攻擊尾蚴后 6周解剖小鼠，肝門靜脈沖洗法收集成蟲記數(shù)，同時(shí)收集每只小鼠的肝臟。稱取肝組織0.5 g，剪碎后加5% NaOH 10 mL，組織勻漿器勻漿，放56℃水浴消化1 h，混勻，吸取20 μL的懸液3份，鏡檢計(jì)數(shù)肝組織蟲卵。按以下公式計(jì)算減蟲率、肝臟減卵率(EPG為平均每克肝組織中所負(fù)荷蟲卵數(shù))。

減蟲率=(1?免疫組平均蟲荷數(shù)/對照組平均蟲荷數(shù))×100%；

減卵率=(1?免疫組EPG/對照組EPG)×100%。

2 結(jié)果

2.1 SjPSMA2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

本研究在對本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的7 d童蟲消減cDNA文庫克隆生物信息學(xué)分析[8]的基礎(chǔ)上，挑選出一個(gè)EST序列并對其進(jìn)行了深入研究。設(shè)計(jì)特異引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得一個(gè)含完整開放閱讀框的基因片段。利用 NCBI的 Blast軟件對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白與PSMA2家族蛋白具有高度同源性，具有十分典型的PSMA2蛋白特征。選擇來自曼氏血吸蟲、鮭瘡痂魚虱、鮑魚、裂喉大馬哈魚、褐家鼠、鹽湖鮭魚、鮐、人(GenBank Accession No.分別為CAZ34242.1、ACO11852.1、ABO26645.1、ACO08660.1、AAH60576.1、ACM08632.1、NP_001019612.1、BAD96696.1)9個(gè)物種的PSMA2蛋白進(jìn)行氨基酸序列的多重比對。結(jié)果顯示，該基因所編碼的氨基酸序列與曼氏血吸蟲的 PSMA2相似性最高，達(dá)到96%(E Value=5e-131)，與人PSMA2的相似性為 73%，其余相似性都在 73%～74%之間(圖1)。據(jù)此，推測該基因編碼的蛋白為日本血吸蟲 PSMA2蛋白，命名為日本血吸蟲 PSMA2(SjPSMA2)。

對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，SjPSMA2基因的ORF為708 bp，編碼235個(gè)氨基酸，理論分子量為25843.34 Da，理論等電點(diǎn)為5.62。該氨基酸序列的N端不具有信號肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)，疏水性區(qū)域分布比較均勻，并且具有多個(gè)抗原肽位點(diǎn)，有良好的免疫原性。

2.2 SjPSMA2基因的期別表達(dá)分析

Real time PCR分析結(jié)果表明， SjPSMA2在日本血吸蟲的7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d蟲體中都有表達(dá)，其中42 d蟲體表達(dá)量最高，7 d和23 d童蟲表達(dá)量較低(圖2)。

2.3 SjPSMA2基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA2在大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)，并且在誘導(dǎo)后5 h的表達(dá)量最高。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組蛋白分子量約為 30 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符(預(yù)測分子量約為25.843 kDa，載體表達(dá)蛋白大約4 kDa)。重組蛋白以包涵體形式存在，溶解于含8 mol/L尿素的PBS。經(jīng)過 Ni-NTA樹脂純化后，獲得了較純的重組蛋白，經(jīng)過6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L尿素的PBS及PBS逐步透析，完成重組蛋白的復(fù)性(圖3)。

圖1 不同物種PSMA2基因氨基酸序列的同源性分析Fig.1 Homology analysis of the amino sequences of magonashi gene among difference species.

圖2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析Sj PSMA2基因在日本血吸蟲不同階段蟲體的表達(dá)情況Fig.2 Stage differential expression of Sj PSMA2 in different stages ofSchistosoma japonicumby real-time PCR.7 d: 7 days schistosomula; 13 d: 13 days schistosomula;18 d: 18 days schistosomula; 23 d: 23 days worms; 32 d: 32 days worms; 42 d: 42 days adult worms.

2.4 表達(dá)產(chǎn)物抗原性的鑒定

以重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，分別用經(jīng)pET28a(+)/BL21大腸桿菌蛋白吸附的日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清和免疫的BALB/c小鼠血清作一抗進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果在30 kDa處有一明顯的識別條帶(圖4A、B)，表明重組表達(dá)產(chǎn)物蛋白具有良好的抗原性。

圖3 SDS-PAGE分析pET28a(+)-SjPSMA2/BL21的蛋白表達(dá)情況Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of pET28a(+)-SjPSMA2/BL21 inE.coli.M: low-molecular protein marker; 1,2: total extract of a clone after and before induction with 1 mmol/L IPTG; 3, 4: total extract of pET28a(+)after and before induction with 1 mmol/L IPTG; 5, 6: inclusion bodies and supernatant after lysis, respectively; 7: rSjPSMA2 purified through Ni2+-charged column chromatography and after dialysis.

將 42 d日本血吸蟲蟲體蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用免疫的 BALB/c小鼠血清作一抗進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果在26 kDa處有一明顯的識別條帶(圖4C)，這與生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。

圖4 pET28a(+)-SjPSMA2重組蛋白的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis ofSjPSMA2expression product.M: marker; 1: expressed product of pET28a(+)-SjPSMA2uninduced.2: expressed product of pET28a(+)-SjPSMA2induced with IPTG; 3: 32-day-old adult worm crude extracts.(A)Recombinant protein was probed with the serum from rabbit immunized withSchistosoma japonicumadult worm antigen preparation;(B, C)Recombinant protein was probed with mouse serum against SjPSMA2.(D)Recombinant protein was probed with the serum from mice immunized with PBS.(E)Recombinant protein was probed with the serum from mice immunized with 206 adjuvant.

2.5 BLAB/c小鼠血清抗SjPSMA2特異性IgG抗體的檢測

用間接 ELISA方法檢測各組小鼠血清中抗SjPSMA2特異性 IgG抗體變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，SjPSMA2免疫組小鼠在第1次免疫后就檢測到較高水平的特異性抗SjPSMA2蛋白的IgG抗體，在第2次免疫后特異性IgG抗體滴度進(jìn)一步升高，但變化很小，第3次免疫后達(dá)到最高。攻擊尾蚴后至解剖，特異性抗體基本保持不變。佐劑對照組及空白對照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中抗SjPSMA2的特異性IgG抗體滴度均未出現(xiàn)明顯的變化(圖5)。

圖5 BALB/c小鼠血清抗SjPSMA2抗原特異性IgG抗體水平檢測結(jié)果Fig.5 Specific IgG level against SjPSMA2 in the sera of BALB/c mice by ELISA.

表1 BALB/c小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab1e 1 Worm and egg counting reduction rate induced by Sj PSMA2 in BALB/c mice

2.6 免疫保護(hù)效果

疫苗免疫保護(hù)效果見表1。與PBS對照組相比，重組蛋白SjPSMA2在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了12.33%的減蟲率，35.23%的肝組織減卵率，差異都顯著(P＜0.05)。

3 討論

蛋白酶體(Proteasome)是一種從真菌到動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的[9]，具有多催化活性的多亞基大分子復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)降解多種短半衰期蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白和核蛋白的細(xì)胞器，參與細(xì)胞周期、特異性基因轉(zhuǎn)錄、抗原處理、分泌、膜蛋白的定位和蛋白質(zhì)的質(zhì)量監(jiān)控等許多重要的過程。蛋白酶體依賴ATP對泛素化的內(nèi)源性蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，它是由沉降系數(shù)為 19S的調(diào)節(jié)復(fù)合物(PA700)結(jié)合在 20S催化核心的兩端而成。19S調(diào)節(jié)復(fù)合物主要起識別泛素化蛋白質(zhì)[10]和調(diào)節(jié)蛋白酶體生物活性的作用[9]；20S催化核心是降解蛋白質(zhì)的核心部分，它是由4個(gè)圓環(huán)疊成的圓筒狀顆粒，每個(gè)圓環(huán)包含7個(gè)亞基，兩外環(huán)由7個(gè)不同的α亞基組成，而兩內(nèi)環(huán)則由7個(gè)不同的β亞基組成[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)所克隆的SjPSMA2是蛋白酶體諸多亞基中的成員之一。泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)除溶酶體途徑之外主要的蛋白降解途徑。在泛素依賴性的蛋白降解途徑中，絕大多數(shù)底物的降解要先與多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合進(jìn)行降解標(biāo)記，泛素偶聯(lián)的蛋白被蛋白酶體識別并迅速降解。蛋白酶體廣泛地存在于酵母、果蠅、吸蟲以及小鼠等生物中，但至今對日本血吸蟲蛋白酶體的研究國內(nèi)外還沒有報(bào)道。蛋白酶體的α亞基既可以自身裝配成環(huán)，也為β環(huán)裝配所必需，并提供了蛋白酶體活化因子 PA700和PA28的結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)α亞基位于20S蛋白酶體的入口處，一方面能控制蛋白質(zhì)的進(jìn)入，另一方面又能阻止部分水解的底物從活性位點(diǎn)釋放，這些都說明α亞基可能在蛋白酶體的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要的作用。血吸蟲從尾蚴侵入終宿主體內(nèi)到發(fā)育為成蟲，在大小、形態(tài)、生物學(xué)和生理學(xué)等方面都發(fā)生了很大變化，這些變化的實(shí)現(xiàn)以大量內(nèi)源性蛋白的降解為基礎(chǔ)，而蛋白酶體又在這一過程中起著重要的作用。通過對蛋白酶體結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，了解各亞基的作用及相互之間的關(guān)系，將會對整個(gè)蛋白酶體在血吸蟲蛋白降解、生長發(fā)育中所起的作用有更深的認(rèn)識。因此，SjPSMA2基因的成功克隆表達(dá)具有重要意義。

研究已表明，蛋白酶體在寄生原蟲的發(fā)育過程中是非常重要的。Shaw等[13]用蛋白酶體抑制劑乳胞素、MG-132作用弓形蟲，蟲體的生長很快受到抑制，而它的子代芽孢的形成和釋放也受到阻礙；Diego等[14]用乳胞素處理克氏錐蟲，能夠阻止其從有鞭毛體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o鞭毛體；Makioka等[15]用乳胞素處理內(nèi)阿米巴原蟲，發(fā)現(xiàn)其包囊期被阻斷；Lindenthal等[16]報(bào)道，用乳胞素處理過的瘧原蟲，從紅細(xì)胞外進(jìn)入到紅細(xì)胞內(nèi)的過程被阻斷。對曼氏血吸蟲的研究表明，通過使用蛋白酶體抑制劑[5]或者進(jìn)行RNAi[6]敲除蛋白酶體的一個(gè)亞基，都能明顯地阻斷蛋白降解的途徑，從而導(dǎo)致曼氏血吸蟲在體外和宿主體內(nèi)不能進(jìn)一步發(fā)育。因此，如果通過人為干預(yù)抑制α2亞基的表達(dá)或者以該亞基作為藥物靶標(biāo)，是否會引起蛋白酶體20S催化核心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮，不能正常的進(jìn)行蛋白降解，并使血吸蟲的生長發(fā)育受到抑制，從而減輕血吸蟲病病理損傷及減少傳染源擴(kuò)散。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明SjPSMA2基因在日本血吸蟲感染宿主后第 7、13、18、23、32、42天都有表達(dá)，在13 d到18 d這個(gè)階段表達(dá)水平都比較高，這個(gè)時(shí)期正好是日本血吸蟲個(gè)體大小變化較大的階段，蛋白代謝比較旺盛，在32～42 d這個(gè)階段，蟲體逐步發(fā)育成熟并且開始產(chǎn)卵，新陳代謝旺盛，該基因的表達(dá)變化特點(diǎn)可能與血吸蟲生長發(fā)育和繁殖有一定的關(guān)系，從側(cè)面揭示了SjPSMA2基因在血吸蟲生長發(fā)育中的重要作用。Western blotting結(jié)果表明該重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，用SjPSMA2重組抗原免疫 BALB/c小鼠后，可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的抗重組抗原的特異性IgG抗體迅速產(chǎn)生，并且維持在一個(gè)較高的水平。初步動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)表明，用重組蛋白免疫誘導(dǎo)了12.33%的減蟲率和35.23%的肝組織減卵率。特異性抗體在殺傷蟲體中可能起了一定的作用，也暗示該重組蛋白具有發(fā)展為抗血吸蟲病候選疫苗及新藥靶的潛力和深入研究的價(jià)值。

本研究首次克隆和表達(dá)了SjPSMA2基因，為探索蛋白酶體在血吸蟲蛋白代謝、生長發(fā)育、繁殖過程中所起的作用以及開發(fā)高效的抗血吸蟲病疫苗和篩選新型的抗血吸蟲藥物都奠定了重要基礎(chǔ)。

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Cloning, expression and characterization of a gene encoding α2 subunit of the proteasome in Schistosoma japonicum

Yang Hong1,2, Hongxiao Han1,2, Jinbiao Peng1, Ye Li1, Yaojun Shi1, Zhiqiang Fu1, Jinming Liu1,Xiangrui Li2, and Jiaojiao Lin1
1 Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science,Shanghai 200241, China 2 College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Received:December 16, 2009;Accepted:January 28, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30671581), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2007CB513108), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA10A207), National Key Technology Research and Development Program of China(No.2006BAD06A09).

Corresponding author:Jiaojiao Lin.Tel: +86-021-34293440; E-mail: jjlin@shvri.ac.cn國家自然科學(xué)基金(No.30671581)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(No.2007CB513108)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2006AA10A207)，國家科技支撐計(jì)劃(No.2006BAD06A09)資助。