分支桿菌噬菌體D29 Lysin B的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

侯麗麗，郝麗梅，祁建城，楊革

1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，曲阜 273165 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所 國家生物防護(hù)裝備工程技術(shù)研究中心，天津 300161

分支桿菌噬菌體D29 Lysin B的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

侯麗麗1,2，郝麗梅2，祁建城2，楊革1

1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，曲阜 273165 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所 國家生物防護(hù)裝備工程技術(shù)研究中心，天津 300161

克隆表達(dá)噬菌體D29 LysinB(LysB)并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。以噬菌體D29基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增lys B基因，與表達(dá)載體pET22b連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coliBL21(DE3)中表達(dá)，鎳柱親和層析(Ni-NTA)純化可溶性表達(dá)產(chǎn)物，并對重組蛋白的活性進(jìn)行分析檢測。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了pET22b-lysB表達(dá)載體，并從1 L的LB培養(yǎng)物中獲得了33.2 mg高純度重組蛋白(His-LysB)；His-LysB具有分解脂肪的能力，屬于脂肪酶；生物化學(xué)特性分析表明：丁酸對硝基苯(pNPB)為水解底物，His-LysB熱穩(wěn)定性不佳，30℃以下比較穩(wěn)定，隨著溫度的升高，穩(wěn)定性逐漸降低；該蛋白具有較高的pH值適應(yīng)性，pH 5.0～9.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高；在23℃和pH 7.5時(shí)酶活力最高，其比酶活為1.3 U/mg；金屬離子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制劑對酶活具有強(qiáng)烈的抑制作用。本研究為開發(fā)新的治療結(jié)核藥物提供了一個新的選擇。

噬菌體，分枝桿菌，裂解酶

Abstract:LysinB(LysB)in mycobacteriophage D29 was cloned and expressed and its enzymatic properties were analysed.ThelysBgene was amplified by PCR from mycobacteriophage D29 genomic DNA and inserted into pET22b vector.The constructed recombinant plasmid was transformed intoEscherichia coliBL21(DE3)to express fusion protein, which was purified by Ni-NTA column and enzymatic activity detected.The results showed that expression plasmid pET22b-lysBwas constructed successfully.Highly purified recombination protein(His-LysB)was obtained 33.2 mg from 1 L LB culture medium.A screening for His-LysB activity on esterase and lipase substrates confirmed the lipolytic activity.Withp-nitrophenyl butyrate as substrate,the thermal stability of the enzyme was poor when the temperature was above 30oC.The enzyme exhibited higher stability at pH 5.0–9.5.The optimum temperature and pH for the lipolytic activity of His-LysB were 23oC and 7.5 respectively.Under theoptimum conditions, the specific activity of His-LysB was 1.3 U/mg.Zn, Cu, Mg, Mnand phenylmethane sulfonyl fruoride severely inhibited the lipolytic activity of His-LysB.The result provides a new option for tuberculosis drug research and development.

Keywords:bacteriophage, mycobacteria, lysins

結(jié)核病是危害人類健康的重大傳染病，由于結(jié)核桿菌的多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的情況日益嚴(yán)峻，迫切需要開發(fā)新型抗結(jié)核藥物來縮短治療時(shí)間，殺死耐多藥與嚴(yán)重耐多藥結(jié)核桿菌。

大量的研究表明，噬菌體裂解酶在體內(nèi)外都有快速有力的殺菌活性，且不會產(chǎn)生耐藥菌株。隨著大量分支桿菌噬菌體基因組測序工作完成，學(xué)者們開始致力于尋找它們的裂解酶基因。研究發(fā)現(xiàn)一些分支桿菌噬菌體的裂解酶基因簇除了編碼內(nèi)溶素和穿孔素之外，還能編碼具有其他活性的蛋白，這主要是由分支桿菌獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定的。分支桿菌的細(xì)胞壁外膜含有豐富的分支菌酸，且該外膜與阿拉伯半乳糖-肽聚糖化合物共價(jià)連接[1-2]。分支菌酸是分支桿菌生長繁殖所必需的，也是抗菌藥物異煙肼等的主要攻擊目標(biāo)。分支桿菌的外膜在獲取營養(yǎng)中起著重要的作用，同時(shí)它也是影響噬菌體裂解的一種潛在障礙[3-4]。因此，為實(shí)現(xiàn)對宿主菌的裂解，分支桿菌噬菌體除了需要編碼能水解肽聚糖層的內(nèi)溶素之外，還需要借助另外一種酶來分解富含分支菌酸的外膜。

分支桿菌噬菌體Ms6的裂解酶基因簇已經(jīng)被鑒定出來[5]，由5個基因組成，除了內(nèi)溶素(LysA)和穿孔素(hol)基因外，位于lysA和hol之間的lysB(gp3)基因所編碼蛋白經(jīng)鑒定[6]具有酯酶和脂肪酶的活性而并非內(nèi)溶素的功能，是噬菌體能編碼具有分解脂肪活性蛋白的首次報(bào)道。噬菌體D29是一種烈性噬菌體，其基因組序列已被全部測定[7]。氨基酸序列分析表明 D29的 LysB(gp12)與 Ms6的LysB同源性為43%，Payne等[8]也已證實(shí)噬菌體D29的LysB不僅具有分解脂肪的活性，還是一種新型的分支菌酸?；⒗肴樘酋ッ?，它能裂解分支菌酸?；⒗肴樘沁B接鍵并釋放出游離的分支菌酸，并指出LysB在裂解的后期通過破壞外膜與阿拉伯半乳糖-肽聚糖層之間的連接來實(shí)現(xiàn)宿主菌的完全裂解。由此可見，噬菌體D29的LysB對于輔助內(nèi)溶素實(shí)現(xiàn)對分支桿菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究克隆出了噬菌體 D29的 LysB基因gene12，采用表達(dá)載體pET22b和表達(dá)宿主菌大腸桿菌 BL21(DE3)，高效表達(dá)并純化了重組蛋白His-LysB，活性鑒定表明His-LysB具有分解脂肪的活性。同時(shí)對His-LysB的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，這不僅為今后研究分支桿菌噬菌體裂解酶基因簇之間及其與宿主菌之間的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，而且對于將裂解酶應(yīng)用于結(jié)核病治療方面具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒

恥垢分支桿菌 ATCC 607和分支桿菌噬菌體D29由中國藥品生物制品檢定所王國治教授惠贈；E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、pMD19-T Vecter購自TaKaRa生物公司；質(zhì)粒pET22b由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所方宏清教授惠贈。

1.1.2 試劑

限制內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、DNA marker DL2000、1 kb DNA ladder marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自TaKaRa生物公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自鼎國生物公司；引物合成與DNA測序由恒博和泰生物科技有限公司完成；培養(yǎng)基Middlebrook 7H9購自Difco公司；Ni-NTA為純泰Puribest產(chǎn)品；丁酸對硝基苯(pNPB)購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體D29 lysB的克隆和重組表達(dá)載體的構(gòu)建

提取 D29噬菌體的基因組[9]，以基因組為模板擴(kuò)增噬菌體D29lysB基因。設(shè)計(jì)的上下游引物分別含有NdeI和NotI酶切位點(diǎn)：上游引物為：5′-AAGGAGATATACATATGAGCAAGCCCTGGCTGT-3′； 下 游 引 物 為 ： 5′-TGCTCGAGTGCGGCCGCG ATCTGTCGTAGGAACTCGACC-3′。PCR 條件：95℃5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min 。

lysB基因片段回收、純化后與 pMD19-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組克隆測序后正確，命名為pMD-lysB。用NdeI/NotI雙酶切pMD-lysB和pET22b質(zhì)粒，切膠回收目的片段后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和NdeI/NotI雙酶切檢驗(yàn)正確后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到表達(dá)菌株BL21(DE3)/pET22b-lysB。

1.2.2 重組LysB的表達(dá)及可溶性分析

挑取BL21(DE3)/pET22b-lysB單菌落，接入含有100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600≈0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol/L，25℃誘導(dǎo)10 h。分別取誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液，超聲破碎，分離可溶性蛋白和非可溶性蛋白，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的可溶性。

1.2.3 重組LysB的純化

離心收集IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10 h的1 L培養(yǎng)菌液菌體(5000 r/min，4℃，10 min)，并重懸于破碎緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，pH 8.0)中超聲破碎，離心收集上清液并過Ni-NTA柱。用 5倍體積的含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗柱后，再分別用含有60、100、150、200、250、300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液分步洗脫，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的純度，采用Bradford法測定蛋白濃度。純化后的重組蛋白經(jīng)超濾離心管(截留分子量 10 kDa)濃縮并用儲存緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl，50%甘油)進(jìn)行透析，分裝后于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組LysB活性分析[10-12]

取 37 μg的 His-LysB滴加在含有 1%(V/V)Tween 80或Tween 20以及1 mmol/L CaCl2的LB平板上，在23℃條件下孵育24 h，觀察有無白色沉淀產(chǎn)生。以蛋白質(zhì)溶解液作為陰性對照。

將適當(dāng)稀釋的酶液加入到200 μL含0.4 μmol/L丁酸對硝基苯(pNPB)的緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.2% Triton X-100)中，于室溫條件下反應(yīng)30 min后測定405 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對硝基苯酚(pNP)的釋放量。以不加酶液的反應(yīng)體系作為空白對照。在一定的溫度和pH條件下，每分鐘從底物溶液中分解產(chǎn)生1 μmoL pNP所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以噬菌體D29基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增lysB基因片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現(xiàn)約 750 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，大小與噬菌體D29的lysB(765 bp)相符。擴(kuò)增產(chǎn)物與 pMD19-T載體連接得到pMD-lysB載體，測序結(jié)果與GenBank公布的核苷酸序列相差一個堿基，但不改變氨基酸殘基。用NdeI/NotI酶切pMD-lysB和pET22b載體，將目的片段回收后連接，得到 pET22b-lysB載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)中，篩選的陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，得到了兩條與預(yù)期大小(5371 bp和769 bp)相符的片段(圖1)，表明重組表達(dá)載體pET22b-lysB構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白(His-LysB)的表達(dá)和純化

將 pET22b-lysB載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明在分子量約為29 kDa處有一明顯的蛋白條帶(圖2)，同預(yù)計(jì)的重組蛋白大小一致(29.5 kDa)，表明BL21(DE3)/pET22b-lysB表達(dá)成功，重組蛋白(His-LysB)約占全菌總蛋白的50%以上。蛋白的可溶性分析表明，重組蛋白(His-LysB)大部分是可溶性的，占全菌可溶性總蛋白含量的48.1%。

收集誘導(dǎo)后的菌體，超聲破碎，離心后取上清用Ni-NTA純化，SDS-PAGE薄層掃描分析顯示其純度大于85%。將純化的目的蛋白進(jìn)行濃縮透析，測定蛋白濃度為3.7 g/L，目的蛋白的獲得量為每升LB培養(yǎng)物33.2 mg，分裝后?20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pET22b-lysB的雙酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of pET22b-lysB.M1: 1 kb DNA ladder marker; M2: DNA marker DL2000; 1: pET22b digested withNdeI/NotI; 2: pET22b-lysBdigested withNdeI/NotI.

圖2 His6-LysB表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET22b-lysBexpression and purification.M: low molecular weight markers; 1,2: uninduced and induced expression of BL21(DE3)carrying pET22b; 3,4:uninduced and induced expression of BL21(DE3)carrying pET22b-lysB, indication about 29 kDa fusion LysB protein; 5:purified His-LysB.

2.3 His-LysB活性鑒定

將純化的 His-LysB滴加在含有 Tween 20或Tween 80的LB平板上，均能觀察到白色沉淀圈(圖3)。Tween 20和Tween 80分別是含12個C的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和含18個C的聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，它們均能被分解脂肪的酶裂解成脂肪酸和乙醇。產(chǎn)生的脂肪酸與 Ca2+則形成不可溶的脂肪酸鹽，因此會在平板上形成白色沉淀。作為陰性對照的重組蛋白溶解液沒有產(chǎn)生白色沉淀。這一結(jié)果表明，His-LysB對脂肪酶作用的底物具有明顯的分解作用，其具有脂肪酶活性。

2.4 His-LysB酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1 反應(yīng)溫度對LysB活性的影響

將適當(dāng)稀釋的酶液加入到含 0.4 μmol/L pNPB的TT緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.2%Triton X-100)中，在不同的溫度下反應(yīng)30 min，測定LysB的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出該酶最適反應(yīng)溫度為23℃左右。

2.4.2 反應(yīng)pH值對LysB活性的影響

圖3 重組蛋白His-LysB的活性鑒定Fig.3 Effect of His-LysB activity on agar plates containing Tween 80 and CaCl2, Tween 20 and CaCl2.

2.4.3 LysB的熱穩(wěn)定性

酶液置于不同溫度下溫浴30 min后，測定LysB的活性，以4℃存放的酶液作為對照，計(jì)算出相對酶活力，結(jié)果如圖6所示，該酶在30℃以下比較穩(wěn)定，溫度高于30℃時(shí)，酶活力下降較快，37℃相對酶活力不到50%，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，相對酶活幾乎為0，說明該酶的熱穩(wěn)定性較差。

2.4.4 LysB的pH值穩(wěn)定性

酶液經(jīng)不同pH的緩沖液稀釋，室溫條件下處理1 h后測定LysB的酶活，結(jié)果如圖7所示，該酶在pH 5.0～9.5之間較穩(wěn)定，相對酶活均大于80%。

圖5 pH對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of His-LysB.

圖6 酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of His-LysB.

圖7 酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of His-LysB.

2.4.5 不同金屬離子以及抑制劑對LysB活性的影響

將酶液加入到含一定濃度的不同金屬離子(5 mmol/L：Ca2+、K+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+)以及抑制劑(10 mmol/L： EDTA、PMSF)的緩沖液中于室溫條件下預(yù)處理 2 h，測定處理后的LysB活性，以未加金屬離子或抑制劑的LysB為對照，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果見表1。除了Ca2+和EDTA對酶活沒有明顯影響外，其余金屬離子以及 PMSF對酶活均有不同程度的抑制，其中以 Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和 PMSF的抑制作用最為強(qiáng)烈。

表1 金屬離子和抑制劑對酶活力的影響Table 1 Effect of different metal ions and inhibitors on His-LysB activity

3 討論

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對噬菌體D29的lysB基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白約占全菌總蛋白的50%以上。蛋白的可溶性分析表明，重組蛋白大部分是可溶性的，占全菌可溶性總蛋白含量的 48.1%。經(jīng) Ni-NTA純化后的重組蛋白在分別含有Tween 80和Tween 20的LB平板上呈現(xiàn)出分解脂肪的活性。這說明該蛋白屬于脂肪酶。以 pNPB為底物，研究了重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明該重組蛋白在23℃和pH 7.5處活性最佳，比活性為1.3 U/mg。該酶的熱穩(wěn)定性較差，在30℃以下比較穩(wěn)定，溫度高于30℃時(shí)，酶活力下降較快；重組蛋白具有較廣的pH范圍，在pH 5.0～9.5之間較穩(wěn)定。在所測試金屬離子和抑制劑中，除了 Ca2+和 EDTA抑制劑對酶活沒有明顯影響外，其余金屬離子以及PMSF酶活均有不同程度的抑制作用，其中以Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和 PMSF的抑制作用最為強(qiáng)烈，所以在該酶在處理和保存的過程中盡量避免與這些影響因子接觸。

噬菌體D29的LysB雖然并沒有表現(xiàn)出內(nèi)溶素的功能，但作為一種脂肪酶在宿主菌的裂解過程中所發(fā)揮的作用是不容忽視的。因?yàn)榉种U菌與其他的革蘭氏陽性菌不同，它含有一個具有高濃度脂質(zhì)(大于60%)的復(fù)雜的細(xì)胞壁。由于細(xì)胞壁中的分支菌酸-阿拉伯半乳糖-肽聚糖復(fù)合物的中心分布著一些特殊的脂質(zhì)，從而使其形成了一種有效的表面滲透障[13]?；诜种U菌的這種細(xì)胞壁復(fù)雜性，分支桿菌噬菌體有必要編碼一種能分解脂肪的酶，以實(shí)現(xiàn)噬菌體對宿主菌的快速裂解。除此之外，由于分支桿菌具有富含分支菌酸的外膜，可能會使內(nèi)溶素在體外難以發(fā)揮活性，從而影響了內(nèi)溶素在治療結(jié)核上的應(yīng)用。通過對 LysB的研究，設(shè)想通過內(nèi)溶素LysA和LysB的聯(lián)合作用也許能實(shí)現(xiàn)對分支桿菌的體外裂解，具體是否可行還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究成功表達(dá)了具有脂肪酶活性的分支桿菌噬菌體D29的LysB蛋白并研究了LysB的酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)新的治療結(jié)核的藥物提供了一個新的選擇。

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住宅小區(qū)與醫(yī)院的間距每降低一千米，房價(jià)增長721元/m2。從圖3（f）可以看出：對房價(jià)影響較大的主要為西崗區(qū)、沙河口區(qū)和甘井子區(qū)。但在沙河口區(qū)和甘井子區(qū)等醫(yī)院分布較集中的區(qū)域出現(xiàn)了醫(yī)院對房價(jià)產(chǎn)生正、負(fù)中心依次顯現(xiàn)的現(xiàn)象，這表示醫(yī)院對房價(jià)的作用并不是單向的。因?yàn)橐恍┑貐^(qū)由于醫(yī)療服務(wù)的便利性，使居民的就醫(yī)條件得到了顯著改善，從而房價(jià)上漲。但一些地區(qū)因?yàn)獒t(yī)院分布太過密集，引發(fā)較多環(huán)境污染和交通擁堵問題，從而引起房價(jià)降低。

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Expression and purification of Lysin B in mycobacteriophage D29 and analysis of its enzymatic properties

Lili Hou1,2, Limei Hao2, Jiancheng Qi2, and Ge Yang1
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China 2 National Bio-protection Engineering Center, Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China

Received:November 26, 2009;Accepted:February 24, 2010

Supported by:Major National Science and Technology Special Projects during the 10th Five-year Plan for Prevention and Treatment of Major Infection Diseases: Study of New Methods for Tuberculosis Treatment(No.2008ZX10003-016).

Corresponding author:Jiancheng Qi.Tel: +86-22-84657486; E-mail: qijch@npec.org.cn Ge Yang.Tel: +86-537-4456909; E-mail: yangge100@126.com國家“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)“十一五”課題《結(jié)核病治療新方法的研究》(No.2008ZX10003-016)資助。