蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達(dá)

陳思，曾磊，陳尚武，孫楊吾，張文，徐海英，馬會(huì)勤

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083 3 北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，北京 100093

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC12和VvSUC27在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達(dá)

陳思1*，曾磊2*，陳尚武2，孫楊吾1，張文1，徐海英3，馬會(huì)勤1

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083 3 北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，北京 100093

本研究通過(guò)對(duì)霞多麗葡萄花前約10 d的花絲進(jìn)行組培誘導(dǎo)，獲得胚性和非胚性?xún)煞N愈傷組織，分別進(jìn)行繼代、組織結(jié)構(gòu)觀察和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)驗(yàn)證。為研究?jī)煞N愈傷組織對(duì)培養(yǎng)基中主要碳源蔗糖的利用特點(diǎn)，根據(jù)GenBank中的定位于細(xì)胞質(zhì)膜的葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC12和VvSUC27的序列，設(shè)計(jì)了這兩種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的PCR引物。以RNAplant試劑法，提取胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織的 RNA，進(jìn)行半定量 RT-PCR。研究表明，31個(gè)循環(huán)半定量RT-PCR結(jié)果中VvSUC12在胚性愈傷和非胚性愈傷中均有表達(dá)，且在非胚性愈傷組織中的表達(dá)水平稍高于胚性愈傷組織，表達(dá)差異未達(dá)到顯著水平，VvSUC27的表達(dá)水平明顯低于VvSUC12，且只在胚性愈傷組織中表達(dá)。提高至 35個(gè)循環(huán)的半定量 RT-PCR結(jié)果顯示VvSUC27基因在非胚性愈傷組織中微弱表達(dá)，而在胚性愈傷組織中的表達(dá)強(qiáng)度較 31個(gè)循環(huán)有所增加，且高于非胚性愈傷。

Vitis viniferaL.，愈傷組織，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，半定量RT-PCR

Abstract:We induced embryogenic calli(EC)and non-embryogenic calli(NEC)from flower filaments of Vitis vinifera L.cv.Chardonnay about 10 days before full bloom.The callus were sub-cultured, observed and verified by somatic embryo induction.PCR primers forVvSUC12andVvSCU27were designed according to the corresponding sequences in GenBank.After RNA extraction with RNAplant for EC and NEC cell lines, we synthesized the 1ststrand DNA for semi quantitative RT-PCR, and normalized the density of the bands against house-keeping geneActin.The results of 31 cycles semi-quantitative RT-PCR showed thatVvSUC12was highly expressed in both EC and NEC, with higher expression intensity in NEC than in EC, but not reached the significantlevel; while the expression ofVvSUC27was only detected in EC, and the expression level was significantly lower than that ofVvSUC12.We increased the semi-quantitative RT-PCR cycle number to 35 and found thatVvSUC27gene was weakly expressed in NEC, in EC the intensity of the band was increased comparing with 31 cycles, and the expression level was higher than that of NEC.The paper discussed the differential expression of the two sucrose transporters and their relationship with the sucrose in the tissue culture medium.

Keywords:Vitis viniferaL., calli, sucrose transporter, semi-quantitative RT-PCR

葡萄Vitis viniferaL.屬多年生木質(zhì)藤本果樹(shù)，具有遺傳背景復(fù)雜、生命周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，傳統(tǒng)育種方法在品種改良上受到很大限制[1]。通過(guò)基因工程的方法對(duì)葡萄品種進(jìn)行改良，大部分都需要利用花絲誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織(Embryogenic Callus，EC)和體細(xì)胞胚。此外，葡萄胚性愈傷組織還是懸浮細(xì)胞系建立、原生質(zhì)體培養(yǎng)、誘變育種、種質(zhì)資源保存的重要基礎(chǔ)和前提條件[2]。目前，胚性愈傷組織的獲得與增殖仍是葡萄生物工程相關(guān)研究的瓶頸之一，主要表現(xiàn)在：以同類(lèi)外植體材料在相同的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)獲得的大部分愈傷組織為非胚性愈傷組織(Non-embryogenic callus，NEC)，在誘導(dǎo)和繼代過(guò)程中，NEC除生長(zhǎng)量明顯大于EC外，其不能被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為EC，作為植株再生材料。上述現(xiàn)象在其他作物中同樣存在[3]。

糖是能量物質(zhì)，也是信號(hào)分子。在大部分植物中，碳水化合物是以蔗糖及其衍生物的形式從植物的源器官到庫(kù)器官進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)腫4]。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)論是 EC的誘導(dǎo)、繼代，還是體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育，人們常常調(diào)整培養(yǎng)基的成分，以期獲得最優(yōu)化的效果。其中，除了激素的差別，糖的種類(lèi)和濃度是主要的調(diào)節(jié)手段之一。有大量研究表明，糖顯著地影響著愈傷組織的形成和發(fā)育，Swedlund和 Locy發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不同的碳源，對(duì)玉米 EC的誘導(dǎo)、繼代，以及幼苗的再生表現(xiàn)不同的結(jié)果，其中山梨醇只能支持 EC的生長(zhǎng)，而不支持NEC的生長(zhǎng)[5]。通過(guò)對(duì)甘蔗EC在不同碳源上的生長(zhǎng)量比較，蔗糖被認(rèn)為是最好的培養(yǎng)基糖源[6-7]。不僅不同類(lèi)型的愈傷組織對(duì)培養(yǎng)基中不同種類(lèi)的糖的利用不同，不同類(lèi)型的愈傷組織中糖含量也可能存在不同，以白三葉草Medicago arboreaL.為材料，無(wú)論外植體為胚軸還是葉柄，EC中的糖含量都高于NEC[8]。

愈傷組織對(duì)糖的吸收和貯存，都涉及糖分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)糖在植物不同細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的不同區(qū)隔(Compartment)間跨膜轉(zhuǎn)移時(shí)，通過(guò)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)模式是最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑之一。膜系統(tǒng)中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括：蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩大類(lèi)，它們對(duì)于糖的運(yùn)輸至關(guān)重要，不僅調(diào)控著糖類(lèi)物質(zhì)在植物體內(nèi)的分配以及在庫(kù)端的積累，其功能的行使還直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)。

在高等植物中，自 1992年Riesmeier等[9]從菠菜中克隆得到第一個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以來(lái)，許多蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相繼從不同植物以及不同器官克隆得到[4]。Davies等[10]于1999年從葡萄果實(shí)中克隆得到了3個(gè)預(yù)測(cè)為葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(VvSUC11、VvSUC12、VvSUC27)，其中兩個(gè)(VvSUC11、VvSUC12)在酵母中得到了功能驗(yàn)證[11]。VvSUC11和VvSUC12在葡萄果實(shí)中具有相似的表達(dá)模式，隨成熟過(guò)程中表達(dá)量增高，二者的主要功能被認(rèn)為是負(fù)責(zé)蔗糖從質(zhì)外體(Apoplast)向薄壁細(xì)胞(Parenchyma cell)裝載；而Vvsuc27的表達(dá)與前兩者有顯著不同，在果實(shí)成熟過(guò)程中表達(dá)量降低[11]。

由同樣外植體起源形成的葡萄EC和NEC細(xì)胞，具有不同的生理、生化和基因表達(dá)特征。Marsoni等[4]從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對(duì)葡萄EC和NEC細(xì)胞進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)在 EC中的表達(dá)顯著高于NEC。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白和代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量在EC和NEC細(xì)胞中存在明顯差異。目前對(duì)葡萄EC和NEC中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的差異表達(dá)還沒(méi)有報(bào)道。蔗糖是目前組培培養(yǎng)基中最主要的碳源，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在葡萄EC和NEC中的差異表達(dá)，對(duì)理解細(xì)胞類(lèi)型分化和糖載體表達(dá)與糖分需求的調(diào)控機(jī)理，以及對(duì)葡萄組織培養(yǎng)外植體脫分化和愈傷組織類(lèi)型形成的誘導(dǎo)取向調(diào)控具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 胚性與非胚性愈傷組織材料

供試植物材料為歐亞種釀酒葡萄品種霞多麗V.viniferaL.cv.Chardonnay，5年生植株。于清晨采摘已進(jìn)入小孢子分化期未開(kāi)放的花序，4℃保存1 d后表面滅菌，解剖分離花絲作為外植體培養(yǎng)材料。葡萄花絲愈傷組織的誘導(dǎo)按照Perl等[13]的方法，培養(yǎng)基為：MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.20 mg/L 6-BA + 5 mg/L AgNO3(附加3%的蔗糖和0.25%的Gelrite)，試劑均來(lái)自 Sigma公司。花絲接種到培養(yǎng)基上后，置于(25±1)℃黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生。接種后約60 d，在體視顯微鏡下根據(jù)愈傷組織的外觀，對(duì)EC和NEC細(xì)胞系進(jìn)行分離和繼代培養(yǎng)，繼代2次(30 d×2)后，取第3次繼代培養(yǎng)15 d后的材料進(jìn)行以下處理：1/3用液氮冷凍后用于RNA的提取；1/3 FAA固定后進(jìn)行石蠟切片和番紅固綠對(duì)染[14]，進(jìn)行光學(xué)顯微組織學(xué)觀察與驗(yàn)證；1/3置于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上[13]，即：NN培養(yǎng)基，附加3%蔗糖，18 g/L麥芽糖，1 g/L酪蛋白水解物，4.6 g/L的甘油，0.25%的 Gelrite，根據(jù)體細(xì)胞胚的產(chǎn)生，對(duì)材料的胚性進(jìn)行發(fā)育驗(yàn)證。

1.2 RNA的提取、純化、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

RNA的提取、純化、反轉(zhuǎn)錄及cDNA的合成參照代茹等[15]的方法。采用 RNAplant試劑(索萊寶生物公司)提取霞多麗葡萄EC和NEC的總RNA，以不含RNase的DNase進(jìn)行純化處理，以紫外分光光度計(jì)(型號(hào) UV-1000)測(cè)定純度及定量(OD260/280、OD260/230)，?80℃保存。采用cDNA一鏈合成試劑盒(Promega公司，美國(guó))，對(duì)純化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA一鏈模板庫(kù)，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 半定量RT-PCR檢測(cè)與基因表達(dá)分析

根據(jù) GenBank上的Actin(GenBank Accession No.AF369524)和VvSUC12(GenBank Accession No.AF021809)、VvSUC27(GenBank Accession No.AF021810)兩個(gè)葡萄基因序列，設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物，引物序列如表 1。引物由上海英駿生物公司合成。

表1 半定量RT-PCR中使用的引物Table 1 Primers used in semi-quantitative RT-PCR

以PCR擴(kuò)增出的條帶清晰可見(jiàn)為原則對(duì)模板濃度進(jìn)行調(diào)整，將反轉(zhuǎn)錄得到的胚性cDNA第一鏈稀釋20倍，非胚性cDNA一鏈稀釋5倍作為半定量PCR模板。在半定量PCR之前，先以稀釋20倍的胚性材料 cDNA第一鏈為模板，根據(jù)所設(shè)計(jì)的VvSUC12、VvSUC27基因引物的各項(xiàng)參數(shù)對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行溫度梯度 PCR，先將循環(huán)數(shù)提高至37個(gè)，其他條件不變，摸索引物與模板結(jié)合的最適溫度。

取 1 μL cDNA第一鏈做模板，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系：2 μL 10×PCR 緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2 μL primer-F(2.5 μmol/L)，2 μL primer-B(2.5 μmol/L)，1 μL 模板，0.2 μL rTaq酶，補(bǔ) ddH2O 至 20 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃熱變性5 min；94℃變性45 s，退火溫度 45 s，72℃延伸 50 s，37 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 8 min；4℃保存。退火溫度在 48℃～55℃設(shè)置梯度，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定最合適的退火溫度。優(yōu)化退火溫度后，按上述程序?qū)⒀h(huán)數(shù)減為31個(gè)進(jìn)行半定量RT-PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用培清JS-680c全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)照相，并用設(shè)備自帶軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析，一般測(cè)定電泳條帶的IOD值(Intergrated optical density)，目的基因相對(duì)表達(dá)量為其電泳條帶的IOD值與內(nèi)標(biāo)基因的電泳條帶的IOD值的比值，然后對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析。

1.4 高效液相色譜法測(cè)定不同愈傷組織中糖的種類(lèi)和含量

每次分別取2 g EC和NEC，在研缽中加5 mL80%乙醇充分研磨，于75℃下振蕩浸提10 min，4000×g常溫離心 15 min，收集上清液，然后各用10 mL 80%乙醇重復(fù)提取2次，取上清液，合并，定容至25 mL，搖勻后取4 mL于75℃烘箱中蒸去乙醇，殘?jiān)? mL重蒸水溶解，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后測(cè)定可溶性糖，重復(fù)提取3次。

使用 Waters 600型高效液相色譜儀，色譜柱為Ca型 Shim-pack SCR-101C(300 mm×7.9 mm i.d.)測(cè)糖專(zhuān)用柱。流動(dòng)相為脫氣重蒸水，流速0.8 mL/min，柱溫 80℃。R410示差折光檢測(cè)器，靈敏度 32。進(jìn)樣量 10 μL。色譜純果糖、葡萄糖、蔗糖內(nèi)標(biāo)購(gòu)自Sigma公司。根據(jù)峰面積和各種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算所測(cè)樣品的含糖量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄愈傷組織的誘導(dǎo)與驗(yàn)證

在花絲的誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較大量的NEC和一定量的 EC，至花絲接種后 60 d，進(jìn)行EC和NEC的分離和第一次繼代時(shí)，EC和NEC的比例大約為1:5，并在年度間有一定的變化。在30 d一次的繼代培養(yǎng)過(guò)程中，NEC生物量的增長(zhǎng)速度大約為EC的2～3倍。外觀上，EC的外觀結(jié)構(gòu)均勻、致密，呈新鮮的黃色(圖1A)；而NEC呈半透明狀、結(jié)構(gòu)疏松、顏色較淺，為淺黃或白色(圖1D)。本試驗(yàn)將EC和NEC經(jīng)固定、切片及番紅固綠對(duì)染后，在顯微鏡下進(jìn)行了觀察。固綠主要對(duì)薄且纖維素含量高的細(xì)胞壁和胞質(zhì)進(jìn)行染色，而番紅主要對(duì)木質(zhì)化的細(xì)胞壁和細(xì)胞核染色。觀察結(jié)果表明，EC細(xì)胞排列緊密、均一，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，由于濃厚的綠色著色細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核被番紅著色，輪廓可見(jiàn)(圖1B)。NEC經(jīng)番紅固綠對(duì)染后觀察，細(xì)胞核不可見(jiàn)，絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞壁沒(méi)有番紅的著色，少數(shù)番紅著色的細(xì)胞分散于其他固綠著色的細(xì)胞中(圖1E)。在體細(xì)胞胚分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上EC和NEC培養(yǎng)后有不同特征，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，EC整體分化生成球形和心形體細(xì)胞胚(圖1C)，而非胚性愈傷組織在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不被誘導(dǎo)分化，仍維持原狀，部分區(qū)域出現(xiàn)褐化(圖1F)。

2.2 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VvSUC12、VvSUC27基因在胚性和非胚性愈傷組織中的差異表達(dá)

進(jìn)行優(yōu)化后的VvSUC12、VvSUC27基因引物的最適退火溫度分別為54.5℃、52.5℃(圖2)。采用優(yōu)化的退火溫度，以適當(dāng)調(diào)整濃度后的cDNA第一鏈為模板，以31個(gè)循環(huán)完成VvSUC12、VvSUC27和Actin特異引物對(duì)的半定量RT-PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，代表性的電泳結(jié)果如圖3A所示，3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的歸一化結(jié)果如圖3B所示。從中可以看出，內(nèi)標(biāo)基因Actin在EC和NEC材料中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的亮度基本一致；VvSUC27在EC中有微弱的表達(dá)，而在NEC中未擴(kuò)增出VvSUC27的條帶，VvSUC12的表達(dá)在 EC和 NEC中都顯著高于VvSUC27，其中在 NEC中的表達(dá)量高于 EC，但統(tǒng)計(jì)分析兩者的表達(dá)差異并未達(dá)到顯著水平。由于31個(gè)循環(huán)的半定量PCR結(jié)果未發(fā)現(xiàn)VvSUC27基因在NEC中的表達(dá)，故將循環(huán)數(shù)提高至35個(gè)循環(huán)進(jìn)一步驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示了 NEC樣品的微弱條帶，而在 EC中的條帶的強(qiáng)度較 31個(gè)循環(huán)時(shí)有所增加(如圖4)。

圖1 霞多麗葡萄不同愈傷組織的誘導(dǎo)與形態(tài)、解剖驗(yàn)證Fig.1 The observation and verification of embryogenic and non-embryogenic callus of Chardonnay.(A)Embryogenic calli(EC).(B)EC stained with Safranin and Fast Green.(C)Somatic embryos were induced from EC on differentiation medium.(D)Non-embryogenic calli(NEC).(E)NEC stained with Safranin and Fast Green.(F)No somatic embryo was induced from NEC on differentiation medium.

圖2 VvSUC12和VvSUC27 PCR條件的優(yōu)化Fig.2 The optimization of PCR condition forVvSUC12andVvSUC27.(A)VvSUC12.M: DNA marker; 1–6: the annealing temperature ofVvSUC12was 50°C, 50.5°C, 51.7°C, 52.8°C, 54°C and 54.5°C respectively.(B)VvSUC27.M: DNA marker; 1–6: the annealing temperature ofVvSUC27was 48°C, 49°C, 51°C, 51.5°C, 52°C and 52.5°C respectively.

圖3 霞多麗胚性和非胚性愈傷組織蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvSUC12和VvSUC27表達(dá)水平的半定量RT-PCRFig.3 The expression ofVvSUC12andVvSUC27in Chardonnay EC and NEC compared with semi-quantitative RT-PCR.(A)The semi-quantitative RT-PCR ofVvSUC12andVvSUC27in Chardonnay EC and NEC.(B)The normalized expression level ofVvSUC12andVvSUC27with house keeping geneActin.The cDNAs concentration of EC and NEC was adjusted to similar concentrations before applied for semi qRT-PCR temples.

圖4 VvSUC27表達(dá)水平的35個(gè)循環(huán)半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The expression ofVvSUC27in EC and NEC compared with 35 cycles semi-quantitative RT-PCR.(A)The semi-quantitative RT-PCR ofVvSUC27in Chardonnay EC and NEC.(B)The normalized expression level ofVvSUC27with house keeping geneActin.The cDNA concentration of EC and NEC was adjusted to similar concentrations before applied for semi qRT-PCR temples.

2.3 胚性和非胚性愈傷組織中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量

以色譜純蔗糖、葡萄糖和果糖為內(nèi)參，通過(guò)液相色譜法測(cè)定了葡萄胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織中的3種主要糖的含量。結(jié)果表明：EC和NEC中果糖含量差別不大，而蔗糖和葡萄糖的含量 EC顯著高于 NEC(P＜0.05)(表 2)。EC中蔗糖的含量是NEC的1倍，這和EC與NEC中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的結(jié)果一致。在EC和NEC中VvSUC12的表達(dá)量相近，而VvSUC27的表達(dá)量在 EC中顯著高于NEC。與VvSUC12相比，VvSUC27具有對(duì)糖更高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[20]。而對(duì) EC中更高的葡萄糖含量，還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究這是由于EC和NEC中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的差異，還是由于轉(zhuǎn)入細(xì)胞的蔗糖存在不同酶解和利用特征等原因。

表 2 胚性和非胚性愈傷組織中葡萄糖、果糖、蔗糖的含量Table 2 Contents of glucose, fructose and sucrose in EC and NEC

3 討論

EC和NEC是從同一組織脫分化后形成的不同多能性的葡萄干細(xì)胞系，其VvSUC12和VvSUC27差異表達(dá)的決定因素，目前尚不清楚。這兩個(gè)基因表達(dá)的，可能是細(xì)胞對(duì)蔗糖的吸收和代謝差異調(diào)節(jié)的反映和表現(xiàn)形式，同時(shí)可能暗示其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也存在一定的差異。根據(jù)對(duì)蔗糖吸收的動(dòng)力學(xué)，可將植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大體分為 2類(lèi)，一類(lèi)具高親和性/低轉(zhuǎn)運(yùn)能力(High affinity low capacity, HALC)，另一類(lèi)則具低親和性/高轉(zhuǎn)運(yùn)能力(Low affinity high capacity，LAHC)[16]。前人的研究結(jié)果表明，HALC類(lèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)蔗糖的韌皮部裝載和回收在長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中從維管組織泄漏出的蔗糖，LAHC類(lèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白盡管對(duì)蔗糖的親和力要弱一些，但在蔗糖濃度高時(shí)卻有助于大量蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。它們主要參與高濃度蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)步驟，向庫(kù)組織大量轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖，在決定庫(kù)容大小上起主要作用，還可能參與蔗糖吸收效率的調(diào)控[18]。

植物中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由一個(gè)基因家族所編碼，其中擬南芥的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族包括 9個(gè)成員，其中7個(gè)編碼具有功能的蛋白質(zhì)[19]。葡萄中根據(jù)基因組序列分析預(yù)測(cè)有4個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20]，目前已知的分別為VvSUC11、VvSUC12和VvSUC27，都屬于定位于細(xì)胞質(zhì)膜的蔗糖-H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Sucrose-H+symporters)，其中VvSUC11和VvSUC12在表達(dá)方式和生化特點(diǎn)上都非常相似[10-11,19]。由GenBank庫(kù)的信息可知，VvSUC12包含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，位于葡萄基因組的1號(hào)染色體上，VvSUC27包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，其染色體定位目前還不清楚。這兩個(gè)基因的克隆都是通過(guò)葡萄的 mRNA文庫(kù)獲得的，VvSUC12(GenBank Accession No.AF021809)mRNA序列全長(zhǎng)2130 bp，編碼 612個(gè)氨基酸；VvSUC27(GenBank Accession No.AF021810)的mRNA序列較短，全長(zhǎng)1925 bp，編碼505個(gè)氨基酸，它們都具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域由大約 20個(gè)氨基酸組成，跨膜結(jié)構(gòu)域之間由短的親水氨基酸序列鏈接，VvSUC12在連接第 6和第 7跨膜域的親水序列區(qū)比VvSUC27多 51個(gè)氨基酸[10]。VvSUC12的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)Km為1.36 mmol/L，屬于HALC類(lèi)型的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在果實(shí)中它主要參與將蔗糖從質(zhì)外體運(yùn)入果肉細(xì)胞[11]，而VvSUC27的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)Km為 8.0～10.5 mmol/L，屬于LAHC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有低親和性/高轉(zhuǎn)運(yùn)能力，在轉(zhuǎn)基因酵母中它對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力受單糖的促進(jìn)和麥芽糖的抑制[19]。以前僅在葡萄的果實(shí)和幼葉中檢測(cè)到VvSUC12的表達(dá)[20]，本研究首次發(fā)現(xiàn)VvSUC12在葡萄胚性和非胚性愈傷組織中也有表達(dá)。VvSUC27與庫(kù)的活性有關(guān)，在未成熟的果實(shí)、花、卷須和根系中都有較高的表達(dá)，而在衰老葉片中的表達(dá)非常低[20]。葡萄的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織作為庫(kù)有一些獨(dú)有的特點(diǎn)，它們不像發(fā)育后期的果實(shí)具有貯存糖分的特點(diǎn)，糖只是被利用而很少被累積，這個(gè)特點(diǎn)可能暗示了為什么在本實(shí)驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)VvSUC12這種高親和性/低轉(zhuǎn)運(yùn)能力的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，而低親和/高轉(zhuǎn)運(yùn)的VvSUC27的基因表達(dá)量很低或沒(méi)有的原因，同時(shí)也為葡萄胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織都能夠在含3%蔗糖的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)提供了解釋。

蔗糖是愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和體細(xì)胞胚分化誘導(dǎo)等各種培養(yǎng)基中最主要的碳源，目前已知的葡萄的3個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也都預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，除了提供生長(zhǎng)和發(fā)育所需的能源，蔗糖和其他單糖還是重要的信號(hào)分子[21]。以甜瓜子葉為材料誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的研究表明，200 mmol/L的蔗糖濃度下體細(xì)胞胚的得率最高，而更高和更低的蔗糖濃度都會(huì)使體細(xì)胞胚的形成受到抑制[22]。需要指出的是，糖的吸收、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，即使是在單一的蔗糖培養(yǎng)基上，由于植物細(xì)胞還能夠分泌胞外轉(zhuǎn)化酶(Invertase)，催化培養(yǎng)基中的蔗糖降解為葡萄糖和果糖，再通過(guò)質(zhì)膜上的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行吸收和相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)，因此單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)對(duì)不同愈傷組織的生長(zhǎng)也起著明顯的作用，這在前人以其他植物種類(lèi)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織為材料所做的不同的單糖培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到了證明[5]。目前葡萄基因組中預(yù)測(cè)的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能多達(dá)59個(gè)[20]，已克隆的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有 5個(gè)(VvHT1-5)，其表達(dá)水平在不同的組織器官中也存在差異[23]，以佳美葡萄果實(shí)的懸浮細(xì)胞系為材料，Conde等[24]的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度能夠從蛋白質(zhì)數(shù)量和轉(zhuǎn)運(yùn)活性?xún)煞矫鎸?duì)VvHT1進(jìn)行調(diào)節(jié)，高葡萄糖含量抑制VvHT1的表達(dá)，而未測(cè)量到其他葡萄單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖含量的響應(yīng)。目前，本課題組正對(duì)葡萄EC和NEC中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)開(kāi)展研究，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更好地解釋EC和NEC對(duì)不同糖信號(hào)的響應(yīng)，以及對(duì)不同碳源的利用，從而為調(diào)整碳源種類(lèi)和濃度提高EC的誘導(dǎo)得率提供參考。

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Differentiated expression of VvSUC12 and VvSUC27 in embryogenic and non-embryogenic calli of Vitis vinifera L.

Si Chen1*, Lei Zeng2*, Shangwu Chen2, Yangwu Sun1, Wen Zhang1, Haiying Xu3, and Huiqin Ma1
1 College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China 2 College of Food Science and Nutrition Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China 3 Institute of Forestry and Fruit Tree Sciences, Beijing Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China

Received:September 15, 2009;Accepted:February 3, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30471212, 30500347), National Modern Grape Industry System(No.nycytx-30-04).

Corresponding author:Huiqin Ma.Tel/Fax: +86-10-62731157; E-mail: hqma@cau.edu.cn*These authors contributed equally to this work.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.30471212, 30500347)，國(guó)家現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(No.nycytx-30-04)資助。