一株牛蒡根際纖維素降解芽孢菌的分離鑒定和發(fā)酵分析

侯進(jìn)慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，葉 駿

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

一株牛蒡根際纖維素降解芽孢菌的分離鑒定和發(fā)酵分析

侯進(jìn)慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，葉 駿

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

從牛蒡根際分離到一株纖維素降解菌株NP10。該菌是芽孢桿菌，其16S rDNA的Genbank序列號(hào)是FJ908093。分批發(fā)酵法對(duì)NP10進(jìn)行的分析顯示，該菌是一株堿性纖維素降解菌。其濾紙酶(FPA)酶活力在32℃、pH8發(fā)酵48h達(dá)到最大為18.2U/mL，其羧甲基纖維素酶(CMCase)活力在32℃、pH7發(fā)酵36h達(dá)到最大，為8.1U/mL。

牛蒡；根際微生物；纖維素降解菌；芽孢桿菌

Abstract：In this study, a cellulose-degrading bacterium, NP10, was isolated from burdock (Arctium lappaL.) rhizosphere. NP10 was identified to belong to the family ofBacillussp. and its 16S rDNA Genbank accession number was FJ908093. Meanwhile,NP10 was identified as an alkaline cellulose-degrading strain through batch fermentation. A maximum filter paper activity of 18.2 U/mL was obtained after 48 h fermentation under the conditions of 32 ℃ and initial pH 8, and the optimal fermentation temperature and duration as well as initial pH were 32 ℃, 36 h and 7, respectively, for achieving a maximum carboxymethyl cellulose activity of 8.1 U/mL.

Key words：burdock；rhizosphere；cellulose-degrading strain；Bacillus

牛蒡(Arctium lappaL.)是兩年生草本植物，在分類上屬于菊科牛蒡?qū)?。牛蒡的肉質(zhì)根肥大，是一種可食用且營養(yǎng)價(jià)值較高的農(nóng)產(chǎn)品，由于其具有抗菌、抑制腫瘤的作用，有著“東洋參”的美譽(yù)。江蘇省徐州市豐縣是我國牛蒡的主要產(chǎn)區(qū)，牛蒡種植面積達(dá)到全國總面積的40%以上[1]，其牛蒡產(chǎn)品出口到日本、韓國等地區(qū)，經(jīng)濟(jì)效益較高。人們對(duì)牛蒡的研究很多都著眼于營養(yǎng)、食用和藥理等方面，而與牛蒡產(chǎn)量息息相關(guān)的微生態(tài)系統(tǒng)特別是根際土壤微生物的研究卻未見報(bào)道[2-4]。根際土壤微生物數(shù)目眾多，種類也因植株而有較大差別，對(duì)其分析不僅可了解根際微生物與植株生長的關(guān)系，而且可以開發(fā)出新型菌種資源。

纖維素是自然界中分布廣泛且產(chǎn)量最豐富的一種碳水化合物資源，但是由于降解困難，導(dǎo)致纖維素資源的利用率非常的低。比如秸稈和皮殼等原料大部分都被焚燒掉，這樣做既危害生態(tài)平衡，又加重環(huán)境污染。纖維素分子可被纖維素酶降解。纖維素酶是一個(gè)酶系，能降解β-1,4-葡萄糖苷鍵。纖維素酶的研究是纖維素資源綜合利用的基礎(chǔ)。同時(shí)，纖維素酶也可以應(yīng)用于牛蒡等農(nóng)產(chǎn)品資源的開發(fā)利用。植物的根莖有著大量的纖維物質(zhì)，而纖維物質(zhì)的降解，對(duì)于提取植物抑菌、抗癌、抗衰老等有效成分有著重要的意義。因此，開發(fā)新型纖維素酶對(duì)于解決食品短缺、環(huán)境污染和能源危機(jī)等問題都有著一定的現(xiàn)實(shí)意義。

在纖維素降解研究中，人們對(duì)于真菌纖維素酶的研究較多，而對(duì)細(xì)菌纖維素酶的報(bào)道較少[5]。因此，需要通過生物工程方法加大對(duì)細(xì)菌纖維素酶的研究，以開發(fā)出特性各異的纖維素酶。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)牛蒡根際微生物的分析中，篩選到一株具有較高纖維素降解活性的菌株NP10，對(duì)其進(jìn)行初步鑒定和酶學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 菌種

在兩年中，從徐州豐縣牛蒡產(chǎn)區(qū)的不同生長點(diǎn)隨機(jī)取樣，采集多株牛蒡，并與根際土壤一同帶回實(shí)驗(yàn)室，完成菌株分離工作。

1.2 試劑

羧甲基纖維素、蛋白胨、酵母膏等分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；用于PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)的分子生物學(xué)試劑分別購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

用于菌株分離的初篩液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、滅菌備用。固體培養(yǎng)基還需加瓊脂粉12g/L，高壓滅菌備用。產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基(g)：羧甲基纖維素10、蛋白胨10、酵母膏5、KH2PO41、MgSO40.2、NaCl 10、葡萄糖2、瓊脂12，去離子水定溶至1L，滅菌備用。發(fā)酵培養(yǎng)基(g)：羧甲基纖維素10、蛋白胨10、酵母膏1、去離子水定溶至1L，滅菌備用。

1.4 菌株分離與純化

分別將5g牛蒡根際土壤樣品加入50mL LB培養(yǎng)基中，在250mL錐形瓶中，以160r/min轉(zhuǎn)速于25℃培養(yǎng)24h。取富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)長出菌落后，再將菌落轉(zhuǎn)接到產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基，于培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)2～4d，然后將質(zhì)量濃度為0.5g/100mL的剛果紅倒入培養(yǎng)基中染色5min，倒掉剛果紅后，使用質(zhì)量濃度為5g/100mL的NaCl溶液浸泡脫色1h[6]。若菌株周圍有透明水解圈出現(xiàn)，則說明該菌株產(chǎn)纖維素酶。纖維素酶可以將培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素水解為小分子質(zhì)量的低聚糖、二糖或單糖，剛果紅與羧甲基纖維素結(jié)合后顯紅色，而與小分子質(zhì)量糖類結(jié)合不顯紅色，因此產(chǎn)纖維素酶菌株周圍出現(xiàn)透明水解圈。對(duì)初篩到的菌株進(jìn)行劃單菌落復(fù)篩。對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量透明水解圈與菌落直徑的比值初步確定產(chǎn)纖維素酶活性高的菌株。

1.5 菌落形態(tài)觀察和生理生化特征分析

在固體培養(yǎng)基上觀察菌落特征，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色觀察，并進(jìn)行菌落生理生化特征分析[7-8]。

1.6 基因組DNA提取和16S rDNA序列分析

提取菌株NP10基因組DNA[9]，作為PCR反應(yīng)模板。使用細(xì)菌通用引物[10]：F：5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇，R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，擴(kuò)增獲得菌株16S rDNA序列。PCR反應(yīng)體系(50μL)：10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，dNTP 4μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加無菌超純水補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序是：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將獲得的16S rDNA 片斷送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。用BLAST程序在GenBank基因庫中將獲得的16S rDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，分析菌株分類地位。

1.7 纖維素酶活性發(fā)酵分析

采用分批發(fā)酵法培養(yǎng)菌株NP10，將種子培養(yǎng)液按2%接種量轉(zhuǎn)接至含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出50mL發(fā)酵液，4000r/min離心10min，取上清作為粗酶液測(cè)定其酶活力。分析該菌產(chǎn)濾紙酶(FPA)、羧甲基纖維素酶(CMCase)的最適發(fā)酵pH值、溫度和時(shí)間[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

圖1 菌株NP10產(chǎn)生的透明水解圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle of NP10

如圖1所示，通過剛果紅染色法從牛蒡根際篩選到多株產(chǎn)纖維素酶菌株，其中菌株NP10產(chǎn)纖維素酶活性較高。

2.2 菌株NP10的鑒定

表1 菌株NP10生理生化特性分析結(jié)果Table 1 Physical and biochemical analyses of strain NP10

菌株NP10的菌落呈圓形、淺黃色、粗糙、不透明、邊緣有皺褶。革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色觀察可見有芽孢形成。菌株NP10的生理生化分析結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)獲得1419bp的16S rDNA序列，分析顯示菌株NP10與Genbank中的Bacillus subtilissubsp. subtilis str.168序列相似性最高，達(dá)到100%，其Genbank序列號(hào)是FJ908093。菌株NP10與芽孢桿菌菌株的比對(duì)結(jié)果見圖2。綜合菌落形態(tài)觀察、生理生化分析和16S rDNA序列特征等結(jié)果，確定菌株NP10是Bacillussp.。

圖2 菌株NP10的16S rDNA序列分析結(jié)果Fig.2 Sequence analysis of NP10

2.3 pH值對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響

圖3 pH值對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過改變培養(yǎng)基的pH值，分析菌株NP10的產(chǎn)酶情況。如圖3所示，在培養(yǎng)基pH值為7時(shí)，CMCase活性達(dá)到最大，在pH值為6和8時(shí)降到50%以下，在pH值小于5或大于9時(shí)則幾乎檢測(cè)不到酶活力。FPA活力在培養(yǎng)基pH8時(shí)達(dá)到最大，在pH5～10之間都有一定的活性。

2.4 溫度對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響

圖4 溫度對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過改變分批發(fā)酵過程中的培養(yǎng)溫度，分析菌株NP10產(chǎn)酶情況。如圖4所示，在發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，CMCase和FPA的活力均達(dá)到最大。在27℃到37℃之間時(shí)，F(xiàn)PA活力變化較大，而CMCase活力在這個(gè)溫度范圍內(nèi)活力都比較高，變化較小。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株NP10產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of cultivation time on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過在分批發(fā)酵過程中定時(shí)分析CMCase和FPA的活性，研究兩種酶的活性變化。如圖5所示，NP10在32℃、pH8時(shí)，分批發(fā)酵48h左右其FPA活力達(dá)到最大，是18.2U/mL；在32℃、pH7時(shí)，分批發(fā)酵36h其CMCase活力達(dá)到最大，為8.1U/mL。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)牛蒡根際可培養(yǎng)微生物分析中發(fā)現(xiàn)了一株產(chǎn)纖維素酶活性較高的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行了鑒定和發(fā)酵分析。實(shí)驗(yàn)獲得了菌株NP10長度1419bp的序列，結(jié)合菌落特征和生理生化分析結(jié)果，初步鑒定此菌株是Bacillussp.。對(duì)NP10進(jìn)行的發(fā)酵分析顯示，該菌是一株堿性纖維素酶產(chǎn)生菌。在32℃ pH8時(shí)，分批發(fā)酵48h，其FPA活性達(dá)到最大值18.2U/mL；在32℃pH7時(shí)，分批發(fā)酵36h，其CMCase活力達(dá)到最大值8.1U/mL。

在纖維素酶活性分析中，目前常用的檢測(cè)方法是FPA和CMCase活性測(cè)定法。其中，F(xiàn)PA活性測(cè)定的底物是濾紙，其活性分析的是3類纖維素酶協(xié)同作用的效果，可以顯示出發(fā)酵液總的酶活力。而CMCase活性測(cè)定法主要說明的是內(nèi)切β-葡萄糖苷酶的活力，對(duì)于纖維素降解應(yīng)用有重要的價(jià)值。與文獻(xiàn)相比，本實(shí)驗(yàn)菌株NP10的CMCase活性較高[13-14]。有研究者分析一株產(chǎn)堿性纖維素酶的假諾卡氏菌屬(Prauseria)放線菌，液體發(fā)酵顯示其CMCase酶活力達(dá)7.64U/mL，在經(jīng)過紫外誘變后活力達(dá)到17.59U/mL[14]。課題組將對(duì)菌株NP10進(jìn)行誘變育種，提高其CMCase酶活力。

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Isolation, Identification and Fermentation Analysis of a Cellulose-degrading Bacterium fromArctium lappaL. Rhizosphere

HOU Jin-hui，CAI Kan，ZHENG Bao-gang，CAO Yu-peng，YE Jun
(Food Engineering (Bioengineering) Department, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)21-0312-04

2010-07-01

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0924)；徐州工程學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目；徐州工程學(xué)院青年重點(diǎn)科研項(xiàng)目(XKY2008110)；江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2010-971)

侯進(jìn)慧(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：houjinhui0@126.com