大腸桿菌O157:H7膠體金試紙條研制

黃嶺芳，段 霞，陳 媛，劉文娟，魏 華，賴衛(wèi)華,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

大腸桿菌O157:H7膠體金試紙條研制

黃嶺芳1，段 霞1，陳 媛2，劉文娟2，魏 華1，賴衛(wèi)華1,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

采用膠體金標(biāo)記抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體(鼠源)，通過(guò)將大腸桿菌O157:H7多克隆抗體和驢抗鼠抗體(二抗)噴涂于硝酸纖維素膜分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，研制大腸桿菌O157:H7膠體金快速檢測(cè)試紙條。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳條件為標(biāo)記量16.8μg/mL、標(biāo)記pH8.0、封閉劑PEG20000、檢測(cè)時(shí)樣品最佳pH7.0～7.5。對(duì)26株常見(jiàn)細(xì)菌交叉反應(yīng)結(jié)果表明，該試紙條除與鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 13311和金黃色葡萄球菌CMCC 26003有輕微交叉反應(yīng)外，與其他24株菌均無(wú)交叉反應(yīng)。該試紙條靈敏度為104CFU/mL。用該試紙條檢測(cè)大腸桿菌O157:H7操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)。

大腸桿菌O157:H7；膠體金；試紙條

大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一種常見(jiàn)的、重要的人畜共患致病菌。它可以引起多種疾病，如出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis)、溶血性尿路綜合癥(haemolytic uremic syndrome)[1-3]和血栓性血小板紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)[4]等，它的感染劑量非常低，食入不足10個(gè)細(xì)菌就可引起疾病[5]。1982年美國(guó)第一次發(fā)現(xiàn)E.coli O157:H7，隨后在美國(guó)、英國(guó)、加拿大、日本、澳大利亞和德國(guó)等地均有此菌感染事件的報(bào)道。我國(guó)受該菌的威脅也越來(lái)越大，2005年鄭州市內(nèi)發(fā)現(xiàn)3例E.coli O157:H7感染病例[6]；據(jù)調(diào)查河南省波爾山羊的帶菌率最高達(dá)到29.8%[7]；張亞利等[8]對(duì)河北省1998年1月1日至1999年12月31日住院病例進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有41例E.coli O157:H7感染疑似病例；徐景野等[9]從2001年一名男性腹瀉患者糞便中分離得到E.coli O157:H7；陳岡等[10]對(duì)上海地區(qū)4家豬場(chǎng)的飼料、飲水、土壤、糞便以及空氣112份樣品進(jìn)行檢測(cè)，在糞便及土壤中均有E.coli O157:H7檢出，其中E.coli O157:H7總陽(yáng)性率為2.68%；朱根忠等[11]對(duì)在江蘇省建湖地區(qū)2008年5月至9月采集腹瀉患者、家禽和家畜的糞便以及水源水、肉制品、蒼蠅等836份樣本進(jìn)行鑒定，檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7陽(yáng)性標(biāo)本17份；馮艷潔等[12]對(duì)秦皇島食品中E.coli O157:H7污染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從220份食品中檢出2株大腸桿菌O157:H7，檢出2株可疑的大腸桿菌O157:H7。因此，建立快速準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)于診斷E.coli O157:H7引起的食物中毒及預(yù)防該菌引起食物中毒均有重要意義。

1971年Faulk等創(chuàng)立免疫膠體金技術(shù)以來(lái)，由于該技術(shù)有方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的應(yīng)用。本研究擬以雙抗夾心為模型，研制E.coli O157:H7膠體金試紙條，并對(duì)試紙條進(jìn)行靈敏度和特異性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌株與抗體

E. coli O157:H7(CMCC 44828) 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；其他菌株為本實(shí)驗(yàn)保存；兔抗E.coli O157:H7多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；鼠抗E.coli O157:H7單克隆抗體 Meridian公司。

1.2 試劑與儀器

氯化金(HAuC14) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；檸檬酸三鈉 北京化工試劑公司；硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊、結(jié)合墊、PVC底板 Millipore公司；PEG20000 Simga公司；BSA 北京新經(jīng)科生物公司；驢抗鼠IgG無(wú)錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司。

紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；Biodot點(diǎn)樣儀、試紙條切刀 Biodot公司；磁力攪拌器 江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將－80℃保存E. coli O157:H7劃線接種于山梨醇麥糠凱平板上，37℃培養(yǎng)18h后挑取典型菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)8h。長(zhǎng)雙歧桿菌等厭氧細(xì)菌劃線接種于MRS平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24h，挑取單菌落于液體MRS中，37℃靜置培養(yǎng)16h。其他細(xì)菌劃線接種于LB平板上，方法同E. coli O157:H7。各種菌均用生理鹽水梯度稀釋后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 膠體金試紙條制備

1.4.1 膠體金制備

膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法。將100mL 0.01% HAuCl4溶液加熱煮沸，然后立即加入1.2mL 1%檸檬酸三鈉溶液攪拌，溶液的顏色由淺黃→藍(lán)色→深藍(lán)→紅色，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)，繼續(xù)回流10min后停止加熱，冷卻至室溫，4℃保存。

1.4.2 標(biāo)記pH值的確定[13]

取7個(gè)2mL離心管，分別加入1mL膠體金溶液，用0.2mol/L K2CO3溶液將pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，各取100μL上述不同pH值的膠體金加入96孔板中，每孔加入10μL 1mg/mL的抗E.coli O157:H7單克隆抗體，混勻，靜置5min后，每孔加入20μL 100g/L NaCl溶液，混勻，室溫條件下放置10min，觀察膠體金顏色變化，保持紅色的pH值即為合適的標(biāo)記pH值。

1.4.3 最佳標(biāo)記量的確定

最佳標(biāo)記量以目測(cè)法確定[14-15]。將待標(biāo)記的抗E.coli O157:H7單克隆抗體逐級(jí)稀釋后，各取10μL加入一系列裝有100μL pH8.0膠體金的離心管中，搖勻室溫放置5min后，分別加入10μL 100g/L NaCl，依次按表1進(jìn)行，混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。保持紅色的離心管中，所含最低蛋白量(穩(wěn)定1mL膠體金的必須蛋白量)的120%即為實(shí)際用量。

1.4.4 封閉劑的確定

取5個(gè)50mL潔凈燒杯，分別加入10mL膠體金，用0.2mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH8.0，分別加入1mL 168μg/mL抗E.coli O157:H7單克隆抗體，攪拌30min，其他試劑按表2加入，4℃、5000r/min離心30min，沉淀用重懸液重懸。用點(diǎn)樣儀將重懸液點(diǎn)樣于結(jié)合墊上(8μL/cm)，真空干燥1～2h，將已純化抗E. coli O157:H7多克隆抗體用pH7.2的PBS稀釋至0.5mg/mL，點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上(1μL/cm)，37℃干燥4～5h。將濾紙、樣品墊、結(jié)合墊和硝酸纖維素膜、吸水紙固定于PVC底板上，依次加入液體LB、PBS及108CFU/mL E. coli O157:H7培養(yǎng)液，10～15min后讀取結(jié)果。

表2 封閉劑的確定Table 2 Design for the optimization of blocking reagents

表1 抗體最佳標(biāo)記量確定Table 1 Design for the optimization of antibody label amount

1.4.5 樣品最佳pH值確定

將PBS的pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，各取100μL加入試紙條中，10～15min后讀取結(jié)果。

1.4.6 試紙條特異性

將培養(yǎng)好的各種細(xì)菌用p H 7.2的P B S稀釋至107CFU/mL，分別取100μL用試紙條檢測(cè)，并用pH7.2的PBS和液體LB作為陰性對(duì)照。

1.4.7 試紙條靈敏度

將E. coli O157:H7培養(yǎng)液用pH7.2的PBS稀釋成103～107CFU/mL，分別加入試紙條中，并用pH7.2的PBS和液體LB作為陰性對(duì)照，10～15min后讀取結(jié)果。

1.5 食品樣品檢測(cè)

市售萵苣、牛肉接種目的菌(E. coli O157:H7)和非目的菌(金黃色葡萄球菌 2 60 0 3、鼠傷寒沙門(mén)氏菌13311)，經(jīng)過(guò)前增菌后，用制備的膠體金試紙條檢測(cè)，以測(cè)定該方法對(duì)于食品樣品的實(shí)用性。

目的菌和非目的菌按1.3節(jié)方法培養(yǎng)后，測(cè)量其OD600，用生理鹽水將全部菌稀釋至102～103CFU/mL，并用平板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)各稀釋液的濃度，目的菌稀釋液記為a液，將非目的菌各取0.5mL混勻記為b液。其他試劑按表3進(jìn)行，將各組37℃搖床培養(yǎng)10h。取各組增菌液用制備的膠體金試紙條檢測(cè)，并將增菌液涂布與山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上(E. coli O157:H7為無(wú)色菌落，其他菌為粉紅色或紅色菌落)，以驗(yàn)證試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備的膠體金分析

制備的膠體金紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖1，其在535nm左右有強(qiáng)吸收峰。用透射電子顯微鏡觀察顆粒大小均一，約為40nm左右(圖2)。

圖1 膠體金紫外掃描圖Fig.1 UV-visible spectrum of colloidal gold

圖2 膠體金電鏡圖Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

2.2 標(biāo)記pH值的確定

圖3結(jié)果表明，pH7.5～8.5時(shí)，膠體金仍保持原來(lái)紅色，膠體金溶液穩(wěn)定，其他pH值條件下的膠體金有不同程度的顏色變淺現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)選擇pH8.0作為標(biāo)記pH值。

圖3 標(biāo)記pH值的確定結(jié)果Fig.3 pH for antibody labeling

2.3 最佳抗體標(biāo)記量的確定

圖4結(jié)果顯示，8～11號(hào)管膠體金保持紅色，因此14μg為穩(wěn)定1mL膠體金的必須蛋白量，本實(shí)驗(yàn)實(shí)際用量為16.8μg/mL(抗E. coli O157:H7單克隆抗體/膠體金)。

圖4 最佳抗體標(biāo)記量的確定結(jié)果Fig.4 Results for the optimization of antibody label amount

2.4 封閉劑的確定

如圖5所示，加入液體LB和PBS時(shí)，1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)T線出現(xiàn)不同程度顯色，而2號(hào)T線不顯色，加入E.coli O157:H7菌液時(shí)，1～4號(hào)T線顯色無(wú)明顯差異。因此本實(shí)驗(yàn)按2號(hào)方法標(biāo)記膠體金。

表3 選擇性增菌實(shí)驗(yàn)方案Table 3 Protocol of selective enrichment experiments

圖5 封閉劑的確定結(jié)果Fig.5 Results for the optimization of blocking reagent

2.5 待檢樣品最佳pH值的確定

待檢樣品的pH值對(duì)膠體金試紙條檢測(cè)影響很大，當(dāng)樣品pH值低至5.0或高至9.0時(shí)，膠體金殘留于結(jié)合墊中，導(dǎo)致試紙條無(wú)效(C線不顯色)。陰性樣品pH值在5.5、6.0、6.5、8.0、8.5時(shí)，試紙條T線呈現(xiàn)不同程度的顯色；而pH值在7.0～7.5時(shí)，T線不顯色，非特異性吸附消除，結(jié)果見(jiàn)圖6。因此檢測(cè)時(shí)應(yīng)將待檢樣品pH值調(diào)至7.0～7.5，以避免假陽(yáng)性結(jié)果。

圖6 樣品最佳pH值的確定結(jié)果Fig.6 Results for the optimization of pH

2.6 試紙條特異性分析

試紙條與其他24株細(xì)菌呈陰性反應(yīng)，包括腸致病性大腸桿菌(EPEC) CMCC44496、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) CMCC 44350、大腸桿菌CMCC 44102、大腸桿菌2DBE2001、阪崎腸桿菌CMCC 45401、阪崎腸桿菌CMCC 45402、福氏志賀氏菌301、福氏志賀氏菌2457、白色假絲酵母Z1、枯草芽孢桿菌168、枯草芽孢桿菌BD366、金黃色葡萄球菌CMCC 26001、金黃色葡萄球菌CMCC 26002、副溶血弧菌CGMCC 1.1997、副溶血弧菌CGMCC1.1616、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC 54001、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC 54007、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705、嬰兒雙歧桿菌ZDY18、短雙歧桿菌C5、青春雙歧桿菌LiB、嗜熱鏈球菌G1、保加利亞乳桿菌F1、變形桿菌CMCC 49027，編號(hào)依次為1～24。與金黃色葡萄球菌CMCC26003(編號(hào)25)、沙門(mén)氏菌ATCC 13311(編號(hào)26)呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，試紙條與pH7.2的PBS(編號(hào)27)和液體LB(編號(hào)28)呈陰性反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 試紙條特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Specificity of the developed strip

2.7 試紙條靈敏度分析

本研究制備的E.coli O157:H7膠體金試紙條的靈敏度為104CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試紙條靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Sensitivity of the developed strip

2.8 食品樣品檢測(cè)

圖8 食品樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Detection of Escherichia coli O157:H7 in food samples

通過(guò)平板計(jì)數(shù)，確定了加入樣品中的目的菌和非目的菌均為10～100CFU。通過(guò)增菌10h，牛肉組1和萵苣組1用試紙條檢測(cè)均為陽(yáng)性，牛肉組2和萵苣組2試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如圖8所示，山梨醇麥康凱瓊脂平板顯示牛肉組1和萵苣組1中幾乎全部為目的菌，與試紙條檢測(cè)結(jié)果相符，而牛肉組2和萵苣組2中只有少數(shù)粉紅色菌落，說(shuō)明通過(guò)添加選擇性試劑抑制了非目的菌的生長(zhǎng)，因此用試紙條檢測(cè)為陰性，從而彌補(bǔ)了試紙條本身特異性不足。

3 討 論

E.coli O157:H7感染已經(jīng)成為一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是預(yù)防該菌感染的重要手段。近年各種細(xì)菌的膠體金快速檢測(cè)試紙條層出不窮。唐景峰等[16]制備了布魯氏菌膠體金試紙條，靈敏度為3×103～5×103CFU/mL之間；辛志明等[17]制備了豚鼠氣單胞菌膠體金試紙條，檢測(cè)靈敏度為106CFU/mL。

蛋白質(zhì)主要通過(guò)電荷吸引力、疏水作用力和共價(jià)鍵吸附在金表面，但離子強(qiáng)度、pH值及封閉劑等會(huì)破壞這3種力從而影響層析系統(tǒng)的性能，造成假陽(yáng)性結(jié)果。本研究著重從消除這種非特異性吸附，對(duì)標(biāo)記時(shí)pH值及封閉劑等進(jìn)行優(yōu)化，制備的試紙條與樣品稀釋液(pH7.2 PBS)及液體LB呈陰性反應(yīng)。試紙條與鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 13311和金黃色葡萄球菌CMCC 26003有輕微的交叉反應(yīng)，這可能是由于E. coli O157:H7與這兩種菌有較多的相似抗原。對(duì)制備的試紙條應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)有以下思路：在樣品前增菌過(guò)程中添加選擇性試劑選擇目的菌，以彌補(bǔ)試紙條特異性方面的不足；試紙條與前增菌培養(yǎng)基、稀釋液應(yīng)配套使用；將待檢樣品pH值調(diào)至7.0～7.5。用本研究所得的試紙條檢測(cè)E.coli O157:H7快速、準(zhǔn)確，具有很好的應(yīng)用前景。

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Preparation of Colloidal Gold Strip for the Detection of Escherichia coli O157:H7

HUANG Ling-fang1，DUAN Xia1，CHEN Yuan2，LIU Wen-juan2，WEI Hua1，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Zodolabs Biological Engineering Co. Ltd., Nanchang 330029, China)

Anti-Escherichia coli O157:H7 monoclonal antibody was labeled with colloidal gold to prepare a strip for the detection of E. coli O157: H7. Anti-E. coli O157:H7 polyclonal antibody and donkey anti-mouse IgG were dispensed on the nitrocellulose membrane as the test line and control line, respectively. The optimal conjugation was performed using 16.8μg/mL antibody at the condition of pH 8.0 and blocked with PEG20000. However, the optimal pH range for the detection was 7.0－7.5. Cross-reaction test was conducted by 26 bacteria strains. Results showed no obvious cross-reaction were observed except for the slight cross-reaction from Salmonella typhimurium ATCC13311 and Staphylococcus aureus CMCC26003.Meanwhile, the sensitivity of the developed strip was up to 104CFU/mL. Moreover, this kind of developed strip was characteristics of simple operation, rapid detection, high sensitivity and specificity.

Escherichia coli O157:H7；colloidal gold；strip

TS207.4

A

1002-6630(2010)24-0355-05

2010-08-03

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(10C26223601934)；南昌市重大產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2009)

黃嶺芳(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：hlf8406@163.com

賴衛(wèi)華(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：talktolaiwh@163.com