低場核磁共振研究pH值對兔肌球蛋白熱凝膠特性的影響

吳 燁，許 柯，徐幸蓮*，牛 蕾

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

低場核磁共振研究pH值對兔肌球蛋白熱凝膠特性的影響

吳 燁，許 柯，徐幸蓮*，牛 蕾

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

研究pH值對兔骨骼肌肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性以及水分移動性的影響。運(yùn)用低場核磁共振測定肌球蛋白凝膠中水的T2弛豫時間，同時測量保水性和硬度并觀察凝膠超微結(jié)構(gòu)。核磁共振結(jié)果擬合后發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)不可移動水和自由水的T22和T23弛豫時間隨著pH值升高而降低，說明水分的移動性隨著肌球蛋白所帶負(fù)電荷數(shù)目增加而減弱；主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T22和T23弛豫時間與保水性、硬度和凝膠孔徑有較強(qiáng)的相關(guān)性；位于等電點(diǎn)附近的樣品在樣品評分圖上與其他樣品有顯著不同。肌球蛋白的蛋白質(zhì)分子表面電荷數(shù)量和分布影響了蛋白質(zhì)分子卷曲和伸展的情況，對最終凝膠保水性、硬度和網(wǎng)孔直徑有很大影響，而T2弛豫時間則能很好的反映這種變化趨勢。

肌球蛋白；凝膠；低場核磁共振；p H值；保水性

肌球蛋白約占肌原纖維蛋白質(zhì)量的50%，是具有重要生物學(xué)功能的鹽溶性蛋白質(zhì)。其熱誘導(dǎo)凝膠機(jī)制與肉制品的多汁性和質(zhì)地有著密不可分的聯(lián)系[1]。熱誘導(dǎo)凝膠的過程是一個復(fù)雜的物理化學(xué)變化過程，其最終結(jié)果是形成了穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，使得水分和其他食品成分填充于其中，并使產(chǎn)品保持固定形狀。這個復(fù)雜的物理化學(xué)變化過程受pH值、離子強(qiáng)度、溫度和時間等諸多因素影響[2]，從而改變凝膠特性，特別是保水性和微觀結(jié)構(gòu)。為了得到最適合的加工參數(shù)和條件，需要對不同加工參數(shù)下的凝膠性質(zhì)進(jìn)行比較。

大量研究證明，pH值對肌球蛋白結(jié)構(gòu)特征和凝膠特性，特別是保水性有較大影響。肌球蛋白的等電點(diǎn)為5.3左右，而典型的肉類制品pH值一般為5.5以上，所以肉類加工中肌球蛋白通常帶負(fù)電荷[3]。pH值影響肌球蛋白凝膠保水性的機(jī)理是通過改變肌球蛋白表面靜電荷的數(shù)量和分布，從而對肌球蛋白分子內(nèi)的折疊狀態(tài)和分子間的相互作用產(chǎn)生影響，最終影響熱誘導(dǎo)形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。

保水性(water holding capacity，WHC)作為肉制品的主要品質(zhì)特性，前人對其做了大量研究[5]。Grau等[6]利用濾紙吸水的方法來測定肉的保水性；Honikel[7]則通過離心去除水分來測定WHC。但是由于這些方法耗時長、重復(fù)性差且需要破壞樣品本身，并不能充分說明肉制品的WHC。具有非零自旋量子數(shù)(I≠0)的任何核子放置到磁場中，都能夠以電磁波的形式吸收或釋放能量，發(fā)生原子核的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信號，這種核對射頻區(qū)電磁波的吸收稱為核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)。NMR根據(jù)頻率可以分為解釋化學(xué)位移的核磁共振波譜儀(又稱高場核磁共振)和探測物理性質(zhì)的核磁共振分析儀(又稱低場核磁共振)。低場核磁共振(low field-NMR)作為一種快速無損的檢測技術(shù)，可以觀察水分中H質(zhì)子的流動和分布，得到水的動態(tài)變化情況，進(jìn)而得出肉制品WHC的相關(guān)信息[8-9]。H質(zhì)子的弛豫時間往往和水分子的流動性有著緊密的聯(lián)系，這種弛豫包括縱向弛豫過程和橫向弛豫過程，為別稱為自旋-晶格弛豫和自旋-自旋弛豫，又稱T1弛豫和T2弛豫。各個系統(tǒng)內(nèi)水分含量和分布不同，都會造成T1和T2弛豫時間的快慢變化。T2弛豫時間比T1弛豫時間對水分分布狀態(tài)更加敏感，所以常常用來與肉制品的WHC進(jìn)行關(guān)聯(lián)[10]。通過分析T2弛豫時間的不同，較容易區(qū)分出易流動損失的水分和通過物理、化學(xué)作用緊密結(jié)合的水分[11]。

Bertram等[12]通過研究肌原纖維蛋白在不同pH值、離子強(qiáng)度和溫度等加工參數(shù)作用下T2弛豫時間分布的差異，來描述蛋白質(zhì)凝膠WHC的變化情況。本研究希望通過類似的方法，即通過低場核磁共振測定弛豫時間T2，觀察在不同pH值下兔骨骼肌肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的水分分布狀態(tài)變化，與凝膠特性如硬度和微觀結(jié)構(gòu)等建立一定的相關(guān)性聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

3月齡的雄性新西蘭白兔(1.5～2.0kg)購于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔場。

乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA) 美國Sigma公司；Triton X-100 美國Amersco公司；其他化學(xué)試劑最低為分析純。

Waring高速組織搗碎機(jī) 美國思伯明設(shè)備有限公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；MicroMR微型核磁共振成像儀 上海紐邁電子有限公司；S3000-N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 肌球蛋白的制備

健康的新西蘭雄性白兔，宰前充分休息，提供飲水，減少應(yīng)激。頭部機(jī)械致昏后，切斷頸部血管放血，迅速剝皮去頭、爪及內(nèi)臟，自來水沖洗去除血跡，瀝干淋水放入冰箱0～4℃約0.5h，剔取腰大肌。肌球蛋白提取方法參照Han[13]和Wang[14]等。純化得到的肌球蛋白，用雙縮脲法[15]測定其濃度，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。肌球蛋白溶解在溶液(0.6mol/L KCl、20mmol/L K2HPO4-KH2PO4、pH6.5)中，貯存于0～4℃，于一周內(nèi)使用。

1.2.2 肌球蛋白凝膠的制備

肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到10mg/mL，調(diào)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。置于水浴鍋中從20℃程序升溫(1℃/min)到中心溫度為70℃保溫20min。凝膠在0～4℃下過夜(12h)。所得的凝膠進(jìn)行保水性、質(zhì)構(gòu)特性測試和掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3 保水性測試

保水性(WHC)通過Kocher等[16]的離心法測量，肌球蛋白凝膠在0～4℃下用10000×g離心10min，記錄離心前后離心管的質(zhì)量，離心出液體的質(zhì)量。每個處理3個重復(fù)。WHC用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：m1為離心過程中水分損失質(zhì)量/g；m2為離心前凝膠的質(zhì)量/g。

1.2.4 質(zhì)構(gòu)特性測試

利用質(zhì)構(gòu)儀的texture profile analysis(TPA)測定凝膠硬度，單位為g。質(zhì)構(gòu)分析參數(shù)設(shè)定：探頭P5(直徑5mm不銹鋼圓柱形探頭)，測試前下降速度2.0mm/s，測試速度1.0mm/s，測試后探頭上升速度1.0mm/s，穿刺測試距離5mm，感應(yīng)力3g，用質(zhì)構(gòu)儀自帶的軟件Texture Expert English 1.22中的TPAFRAC.MAC過程進(jìn)行分析，計(jì)算凝膠的硬度。每個處理3個重復(fù)。

1.2.5 掃描電子顯微鏡

凝膠樣品切成均勻小塊，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定2h，然后經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%的乙醇溶液梯度脫水各15min，100%的乙醇脫水3次，每次30min。樣品用叔丁醇置換3次，每次3min，取出后進(jìn)行冷凍干燥并將其粘到樣品臺上，用離子濺射儀給樣品鍍上10nm的金膜。通過掃描電子顯微鏡觀察，加速電壓為15kV，每個樣品觀察8個區(qū)域。利用工具對凝膠孔徑直徑Image-Pro Plus (5.1.0.20)進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，每個樣品統(tǒng)計(jì)3張圖片，每張圖片統(tǒng)計(jì)10個不同孔徑。

1.2.6 NMR自旋-自旋弛豫時間(T2)測量

NMR弛豫測量在紐邁MicroMR微型核磁共振成像儀上進(jìn)行。測試條件為：質(zhì)子共振頻率為22.6MHz，測量溫度為32℃。大約2g樣品放入直徑15mm核磁管，而后放入分析儀中。自旋-自旋弛豫時間T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進(jìn)行測量。所使用參數(shù)為：τ-值(90°脈沖和180°脈沖之間的時間)為300μs。重復(fù)掃描32次，重復(fù)間隔時間為6500ms得到16000個回波，得到的圖為指數(shù)衰減圖形，每個測試3個重復(fù)。NMR弛豫測量得到的圖為指數(shù)衰減曲線，其數(shù)學(xué)模型為[17]：

式中：A(t)為衰減到時間t時的幅值大?。籺為衰減時間；A0i為第i個組分平衡時的幅值大小；T2i為第i個組分的自旋-自旋弛豫時間。

CMPG指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的MultiExp Inv Analysis 軟件進(jìn)行反演，得到T2值。該軟件使用整體迭代修正的NMR弛豫信號多指數(shù)反演算法，結(jié)果為離散型與連續(xù)型相結(jié)合的T2譜，它在信噪比較低的情況下仍能保持弛豫譜的真實(shí)性。反演的結(jié)果為生成弛豫圖和各個弛豫過程的弛豫幅值、其對應(yīng)時間常數(shù)(峰值)及其所占面積分?jǐn)?shù)、每個峰起始時間和結(jié)束時間等。為了分析的方便，采用弛豫圖每個組分峰值對應(yīng)的時間作為T2，而弛豫峰的寬度為基線上峰底的寬度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SAS 8.01 (Statistics Analysis System，SAS)進(jìn)行方差分析，如果方差分析效應(yīng)顯著，使用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較(P＜0.05)。用Statistica 8.0對WHC、硬度、凝膠孔徑和NMR T2反演結(jié)果進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，從而在盡可能多的保留原始數(shù)據(jù)信息的前提下對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 保水性和硬度的變化

在肉以及肉制品生產(chǎn)加工中，蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力決定了保水性，保水性對肉的嫩度、多汁性和顏色都有較大影響，是客觀評價(jià)肉以及肉制品的重要指標(biāo)。肌球蛋白在熱誘導(dǎo)凝膠過程中發(fā)生變性聚集，交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并把水分包含在其中。不同pH值下肌球蛋白加熱凝膠后，保水性和硬度發(fā)生了比較明顯的差異。

由圖1可以看出，pH5.5時，肌球蛋白保水性較差((34.92±3.19)%)，與其他pH值有顯著差異(P＜0.05)。隨著pH值升高，保水性顯著增加(P＜0.05)，pH6.5、7.0、7.5的保水性分別為(68.17±3.76)%、(67.37±5.72)%、(66.52±4.68)%，三者之間無顯著差異(P＞0.05)，說明當(dāng)pH值達(dá)到6.5以后，保水性趨于穩(wěn)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靠近等電點(diǎn)附近的肌球蛋白凝膠保水性明顯要比遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的凝膠差，這與豬肉肌原纖維蛋白WHC和pH值的關(guān)系類似[18]。Liu等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌球蛋白凝膠在pH5.5時WHC為31.2%，最大WHC出現(xiàn)在pH7.0～9.0。pH值對肌球蛋白表面凈電荷數(shù)量的影響決定了水分在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的分布與含量。pH5.5時肌球蛋白分子所帶電荷較少，蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下就發(fā)生了自然聚集，加熱形成凝膠發(fā)生明顯縮水，導(dǎo)致保水性較差。隨著pH值的升高，肌球蛋白表面所帶負(fù)電荷增加，蛋白分子之間靜電排斥作用增強(qiáng)，為水分提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)，同時增加了水化表面積。

不同pH值下的肌球蛋白凝膠硬度見圖1。蛋白凝膠硬度反映了肉以及肉制品的感官特性如嫩度等。凝膠硬度與形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密度有密切關(guān)系。肌球蛋白凝膠在pH5.5時硬度明顯小于其他組(P＜0.05)。隨著pH值逐漸增大，在pH6.5出現(xiàn)了最大硬度值(28.34±3.36)g，且與pH6.0的硬度值(25.56±3.56)g有顯著差異(P＜0.05)，與pH7.0和7.5的值((26.32±3.10)g和(25.70±4.89)g)無顯著差異(P＞0.05)。對牛血清白蛋白(BSA)和大豆蛋白凝膠性質(zhì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度與蛋白質(zhì)變性程度在給定條件下的展開程度有關(guān)，變性程度越高、功能基團(tuán)暴露越大，凝膠強(qiáng)度越大[20]。pH值在接近等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子上正負(fù)電荷數(shù)目接近，發(fā)生相互吸引，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生無規(guī)則的卷曲和分子團(tuán)聚，使得各種功能基團(tuán)都被包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，無法充分暴露；在pH值高于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子上所帶負(fù)電荷數(shù)目多，靜電斥力使其分子結(jié)構(gòu)舒展伸張，充分暴露了巰基、疏水基團(tuán)和其他共價(jià)鍵基團(tuán)，使得熱凝膠過程可能發(fā)生的交聯(lián)更多，凝膠強(qiáng)度更大，結(jié)果測得凝膠硬度也較大。

圖1 pH值對肌球蛋白凝膠保水性和硬度的影響Fig.1 Effect of pH on WHC and hardness of myosin gel

2.2 掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖2為不同pH值下肌球蛋白凝膠掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果。圖2A為處于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)，其凝膠網(wǎng)孔較大且網(wǎng)絡(luò)狀蛋白質(zhì)絲發(fā)生明顯的斷裂，有明顯未參與凝膠的肌球蛋白形成了團(tuán)塊狀的蛋白聚集體。圖2B中pH6.0的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較pH5.5明顯致密，幾乎不存在團(tuán)塊狀的蛋白聚集體，但還是有部分網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂。pH6.5和7.0的凝膠其微觀結(jié)構(gòu)較好(圖2C、圖2D)，網(wǎng)孔較小且分布均勻，出現(xiàn)了層疊的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，無明顯斷裂和團(tuán)塊狀蛋白聚集體。圖2E中pH7.5的蛋白質(zhì)其凝膠微觀結(jié)構(gòu)稍比pH6.5和7.0差，出現(xiàn)了較小的團(tuán)塊狀蛋白聚集體。

圖2 pH值對肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of pH on microstructure of myosin gel

圖3 pH值對肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔直徑的影響Fig.3 Effect of pH on mesh diameter in microstructure of myosin gel

圖3為肌球蛋白凝膠網(wǎng)孔直徑隨著pH值變化而變化的情況。凝膠網(wǎng)孔直徑在pH5.5的時候?yàn)?12.27±3.10)μm，明顯要大于其他各組，這與之前的保水性結(jié)果相互印證。網(wǎng)絡(luò)孔徑大，其水分流動就較容易，同時蛋白質(zhì)與水分子的相對接觸面積就較小，導(dǎo)致水化表面積較小，而較為松散的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和斷裂的網(wǎng)孔蛋白質(zhì)絲都是造成硬度較差的原因之一。pH6.5的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)孔直徑最小，其對應(yīng)的保水性和硬度值也是最高的，說明在該pH值下形成了良好結(jié)構(gòu)的凝膠，而且還印證了肌球蛋白凝膠孔徑大小與保水性和質(zhì)構(gòu)特性之間的關(guān)系。pH6.5、7.0、7.5的孔徑大小分別為(3.33±0.34)、(4.15±0.64)、(4.52±0.32)μm，它們之間無顯著差異(P＞0.05)，說明隨著pH值逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，肌球蛋白分子表面所帶電荷數(shù)量接近飽和，形成的凝膠結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，不隨pH值發(fā)生明顯變化，保水性和硬度的變化也證實(shí)了這種觀點(diǎn)。

2.3 低場NMR T2弛豫時間的變化

圖4 pH值對肌球蛋白凝膠橫向弛豫時間(T2)的影響Fig.4 Effect of pH on transverse relaxation times (T2) of myosin gel

從圖4可以看出，對CPMG脈沖序列得到的衰減曲線進(jìn)行多指數(shù)擬合后，發(fā)現(xiàn)T2在1～10000ms的弛豫時間分布上出現(xiàn)了3個峰，這與用NMR測量乳清蛋白與卵白蛋白中得到的結(jié)果相類似[21]。分別對這3個峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出圖5和圖6。圖5為pH值對肌球蛋白凝膠T2弛豫時間的影響，圖6為pH值對各個T2組分峰面積百分?jǐn)?shù)的影響。

圖5 pH值對肌球蛋白凝膠T21、T22和T23弛豫時間的影響Fig.5 Effect of pH on T21、T22 and T23 relaxation time of myosin gel

圖6 pH值對肌球蛋白凝膠T21、T22和T23峰面積百分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of pH on peak areas of T21、T22 and T23 of myosin gel

從圖5分析得出，這3個峰對應(yīng)時間為T21：1.15～8.11ms；T22：132.19～705.48ms；T23：1072.27～3274.55ms。這3個峰可能分別對應(yīng)于結(jié)合水(T21)、不易移動水(T22)和自由水(T23)[13]。圖6的結(jié)果表明，在肌球蛋白凝膠中，結(jié)合水比例很小，低于5%；自由水約占10%～20%；不易移動水占絕大多數(shù)，比例超過了7 0%～80%。

T21弛豫時間和所占峰面積百分?jǐn)?shù)都不隨pH值變化而發(fā)生顯著變化(P＞0.05)，說明結(jié)合水在不同pH值變化過程中都穩(wěn)定的存在，且不隨肌球蛋白分子所帶電荷變化而變化。T22在pH值變化過程中發(fā)生比較明顯的變化，其趨勢為隨著pH值升高T22弛豫時間顯著降低(P＜0.05)。T22弛豫時間的降低，說明這部分水分的流動性逐漸變差，趨于一個不易流動的狀態(tài)。同時由于T22弛豫時間在整個肌球蛋白凝膠水分分布中約占80%以上，而且隨著pH值增加，這部分水所占百分比也在增加，這說明T22弛豫時間變緩的趨勢代表了凝膠中主要比例水分變化的趨勢。T23弛豫時間普遍大于1000ms，所對應(yīng)的比例隨pH值變化無顯著變化(P＞0.05)，其弛豫時間變化趨勢與T22類似，隨著pH值升高而顯著降低(P＜0.05)，說明這部分水的流動性也受到了限制。T22和T23弛豫時間變化的原因可能與pH值影響蛋白質(zhì)分子表面電荷數(shù)量和分布有關(guān)[22]。

保水性、硬度和微觀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔直徑的變化與蛋白凝膠T22和T23時間變化可能有一定內(nèi)在聯(lián)系。T22對應(yīng)凝膠中的不易移動水，其對應(yīng)弛豫時間變緩，可能是因?yàn)槟z結(jié)構(gòu)逐漸致密，導(dǎo)致了填充在凝膠孔徑中的水分與蛋白接觸面積更大，蛋白質(zhì)表面基團(tuán)與水分子相互作用導(dǎo)致了水分移動性下降。T23對應(yīng)凝膠中的自由水，自由水移動性下降的原因可能是因?yàn)槟z孔徑變小，水分在凝膠網(wǎng)絡(luò)中自由流動的空間減少。Bertram等[23]通過研究得出豬肉WHC和T2弛豫時間分布的關(guān)系，也得出了兩者有較強(qiáng)的相關(guān)性。

圖6結(jié)果表明，隨著pH值升高，T21峰面積百分?jǐn)?shù)基本保持不變，T23峰面積百分?jǐn)?shù)逐漸變小，而T22峰面積百分?jǐn)?shù)逐漸變大。這說明了隨著蛋白質(zhì)表面電荷數(shù)增多和形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密度增加，一部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰滓苿铀?。這種水分狀態(tài)轉(zhuǎn)化說了水分的流動性逐漸降低，與隨著pH值升高保水性逐漸增加的趨勢相一致。

2.4 保水性、硬度、網(wǎng)孔直徑和T2弛豫時間的主成分分析

pH值影響下保水性、硬度、網(wǎng)孔直徑和T2弛豫時間各參數(shù)之間可能存在線性相關(guān)性，因此在盡量多的保留原始信息情況下，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

表1 pH值影響下變量的主成分分析Table 1 Principal component analysis of variables at various pH levels

表1顯示了不同p H值處理樣品前3個主成分(principal component，PC)對總體方差的解釋情況，第一個主成分能解釋總體方差變異的76.846%，說明了原始數(shù)據(jù)之間存在著較強(qiáng)相關(guān)性。前兩主成分對總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)達(dá)到91.343%，基本可解釋原有所有指標(biāo)包含的全部信息，且特征值都大于1，所以選取第1和第2個主成分作為評價(jià)pH值變化過程中保水性、硬度、網(wǎng)孔直徑和T2弛豫時間各參數(shù)的綜合指標(biāo)。表2為第1和第2個主成分中各變量的特征向量，其絕對值表示了各個變量對主成分的貢獻(xiàn)大小。

表2 主成分1和主成分2的特征向量Table 2 Characteristic eigenvectors of principal component 1 and 2

圖7 不同pH值處理變量在第1、2主成分評分圖Fig.7 Scores of principal components 1,2 after variables treated at various pH conditions

從表2可以分析得到，第1個主成分其特征向量中X1、X2、X3、X5、X6、X8和 X9的系數(shù)絕對值相差不大，說明了第一個主成分綜合了pH值變化過程中保水性、硬度、網(wǎng)孔直徑和T22與T23弛豫時間參數(shù)的主要變化。第2個主成分的解釋方差為14.50%，其特征向量中X4和X7的系數(shù)絕對值最大，其他系相對較低，說明這兩者對第2主成分貢獻(xiàn)較大。

圖7為不同pH值處理變量在第1、2主成分平面的得分散點(diǎn)圖。第1主成分主要與T22、T23、T23p和網(wǎng)孔直徑顯正相關(guān)，與保水性、硬度和T22p顯負(fù)相關(guān)。第2主成分主要與T21顯正相關(guān)，與T21p顯負(fù)相關(guān)。圖8為不同pH值處理樣品在第1、2主成分評分。

圖8 不同pH值處理樣品在第1、第2主成分評分Fig.8 Scores of principal components 1,2 after samples treated at various pH conditions

由圖8分析得出，接近等電點(diǎn)的樣品(pH5.5)位于第一象限，其特征為低保水性、低硬度、較長的T2弛豫時間和網(wǎng)孔直徑大。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)樣品(pH6.5、7.0、7.5)集中在第二、三象限，相互接近，共同特征為高保水性、高硬度、較短的T2弛豫時間和網(wǎng)孔直徑小。接近和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的樣品分別的位于第1主成分的左右兩端，說明了這種差異主要是保水性、硬度、網(wǎng)孔直徑和T22、T23弛豫時間的不同造成的。

3 結(jié) 論

pH值的變化引起兔骨骼肌肌球蛋白的凝膠特性和微觀結(jié)構(gòu)特征都發(fā)生顯著變化。隨著pH值逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，保水性、硬度和T22峰面積百分?jǐn)?shù)等都增加；網(wǎng)孔直徑、T22弛豫時間、T23弛豫時間和T22峰面積百分?jǐn)?shù)逐漸降低；主成分分析得出低場核磁共振T2弛豫時間與肌球蛋白凝膠保水性等凝膠特性有很強(qiáng)的相關(guān)性，同時也能解釋微觀結(jié)構(gòu)變化；肌球蛋白蛋白分子表面電荷數(shù)量和分布影響了蛋白分子卷曲和伸展的情況，對最終凝膠保水性、硬度和網(wǎng)孔直徑有很大影響。目前研究發(fā)現(xiàn)，雖然T2與保水性等存在較強(qiáng)的相關(guān)性，但多種因素對T2弛豫時間的影響并不都是線性的，還沒得出很好的回歸方程來定量分析兩者之間的關(guān)系，因此，需要深入的研究。

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Effect of pH on Gelation Properties of Rabbit Myosin

WU Ye，XU Ke，XU Xing-lian*，NIU Lei
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to investigate the effect of pH on water-holding capacity and water mobility of heat-induced gelation from rabbit myosin, gelation properties of rabbit myosin were characterized through determining relaxation time (T2) of water using low-field nuclear magnetic resonance (NMR), and water-holding capacity (WHC), hardness and ultra microstructure of the gel.NMR results indicated that relaxation time for immobile water (T22) and relaxation time for free water (T23) exhibited a decrease as the increase of pH, which suggested that the slow water mobility resulted from the increased number of negative charge in myosin. Principal component analysis results revealed that T22 and T23 relaxation time had strong correlation with WHC, hardness and diameter of the gel. A significant difference was observed between samples near pI points and other samples. Moreover, the number and distribution of surface charge exhibited an effect on curling and stretching of myosin molecules, and finally affected WHC, hardness and mesh diameter of the gel, while T2 relaxation time could reflect this tendency well.

myosin；gel；low-field NMR；pH value；water-holding capacity

TS201.21

A

1002-6630(2010)09-0006-06

2009-10-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771526)

吳燁(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄焚|(zhì)量控制。E-mail：njwy418@126.com

徐幸蓮(1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：xlxu@njau.edu.cn