蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的化學(xué)及酶穩(wěn)定性研究

于志鵬，趙文竹，于一丁，劉博群，劉靜波*

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長(zhǎng)春 130062)

蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的化學(xué)及酶穩(wěn)定性研究

于志鵬，趙文竹，于一丁，劉博群，劉靜波*

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長(zhǎng)春 130062)

以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性為指標(biāo)，通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)研究影響蛋清蛋白質(zhì)降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性的因素，同時(shí)考察蛋清蛋白質(zhì)降壓肽在模擬胃腸道環(huán)境中的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：pH值、溫度、光照、空氣、貯藏肽溶液的質(zhì)量濃度、巴氏滅菌處理、超聲波及鎂離子等因素對(duì)蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的化學(xué)穩(wěn)定性影響不顯著(P＞0.05)；蛋清蛋白質(zhì)降壓肽經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后活性由46.0%分別下降為13.0%和4.0%，對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶均沒(méi)有良好的耐受性。

蛋清蛋白質(zhì)；肽；穩(wěn)定性；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶通過(guò)影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)對(duì)人體血壓調(diào)節(jié)有重要的生理作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(降壓肽) 是一類(lèi)具有抑制ACE 活性的物質(zhì)。隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的高度關(guān)注，食源性降壓肽成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。自1965年首次在南美茅頭蝮蛇毒液中發(fā)現(xiàn)降壓肽[2]以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員已從不同來(lái)源的蛋白質(zhì)中制備出各種具有降壓活性的肽類(lèi)物質(zhì)[3-8]。但是這些研究主要集中在降壓肽的高效分離制備及構(gòu)效關(guān)系的研究上[9-12]，而對(duì)貯存的環(huán)境條件、加工條件和胃腸道酶耐受性等性質(zhì)對(duì)其活性影響卻報(bào)道很少。由于多肽中的氨基酸組成復(fù)雜，且各氨基酸性質(zhì)不一，這使得其在生產(chǎn)、應(yīng)用和貯存過(guò)程中存在著因脫酰胺、氧化、水解或環(huán)化等作用而發(fā)生降解的可能，甚至有可能導(dǎo)致活性完全喪失[13]。蛋清降壓肽無(wú)論是作為功能性食品還是藥品，最終都要攝入人體內(nèi)才能發(fā)揮其降低血壓的作用。在人體胃腸道復(fù)雜的環(huán)境下，蛋清降壓肽容易受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影響，其中高活性肽段的一級(jí)結(jié)構(gòu)裂解失活，在體內(nèi)失去降壓活性。因此蛋清降壓肽的抗胃腸道酶降解的能力成為一個(gè)很值得關(guān)注的問(wèn)題。研究蛋清降壓肽活性穩(wěn)定性對(duì)于制定科學(xué)的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用方法具有重要的指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)具有降壓活性的抗酶解活性肽提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在前期蛋清降壓肽研究的基礎(chǔ)上，對(duì)蛋清降壓肽的化學(xué)穩(wěn)定性及在體外模擬胃腸道環(huán)境中抗胃腸道酶降解的能力進(jìn)行研究，為蛋清降壓肽的工業(yè)化生產(chǎn)以及體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)和在小腸內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清蛋白粉 吉林金翼蛋品有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、卡托普利(captopriL)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、馬尿酸(hippμric acid)、胃蛋白酶和胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純) 和三氟乙酸(色譜純) 天津市博迪化工有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010高效液相分析儀(紫外檢測(cè)器、C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)和LC solution 工作站) 日本島津公司；超速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；100～1000μL 移液器和10～100μL移液器 Pipette 公司；CS-501型超級(jí)恒溫水浴鍋 上海錦屏儀器有限公司；ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司-雷磁儀器廠；AG204型電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器 江蘇金壇榮華儀器有限公司；B-191噴霧干燥機(jī) 瑞士Buchi公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清降壓肽的制備

取一定量蛋清蛋白質(zhì)配制成一定質(zhì)量濃度的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90℃熱變性10min。冷卻至酶解溫度，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH值至酶解條件，加入一定量的堿性蛋白酶進(jìn)行水解，水解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的氫氧化鈉溶液以維持pH值在規(guī)定的范圍內(nèi)(±0.05)，水解3h后經(jīng)80℃滅酶10min，9000×g離心10min，噴霧干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測(cè)定

采用pH-stat法，參考文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行。

1.3.3 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性測(cè)定

在Cushman等[15]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些修改。取30μL HHL底物液，加入10μL抑制劑混合均勻，在(37±0.5)℃ 恒溫水浴中預(yù)熱3～5min，然后加人20μL ACE液充分混合，37℃保溫30min后，再加入60μL的1mol/L HCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。同時(shí)用10μL pH8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用0.45μm濾膜過(guò)濾后直接用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件：柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動(dòng)相乙腈-水(0.05% TFA)體積比為25:75等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm。ACE抑制活性計(jì)算公式如下：

式中：M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

1.3.4 蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性研究

影響活性肽穩(wěn)定性的因素諸多，溫度、光照、超聲波、濕度、緩沖鹽的種類(lèi)、pH值以及氧氣等對(duì)活性肽的穩(wěn)定性都具有不同程度的影響。實(shí)驗(yàn)中選定pH值(以磷酸緩沖鹽配置)、溫度、光照、空氣、貯藏肽溶液的質(zhì)量濃度、巴氏滅菌處理、超聲波及鎂離子(硫酸鎂鹽)作為試驗(yàn)因素進(jìn)行考察。應(yīng)用Minitab 15.1.0軟件對(duì)影響蛋清高F值寡肽穩(wěn)定性的因素進(jìn)Plackett-Burman設(shè)計(jì)(因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1)。對(duì)可能影響蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性的8個(gè)主要因素進(jìn)行篩選，每個(gè)變量分別確定(+)和(－)兩個(gè)水平，以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性抑制率為指標(biāo)，共進(jìn)行12次試驗(yàn)以確定每個(gè)因素對(duì)蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性的影響。

表 1 蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels for stability of antihypertensive peptides from egg white protein

1.3.5 蛋清降壓肽抗酶解研究

在模擬胃腸道環(huán)境下，蛋清降壓肽還存在活性制約其體內(nèi)作用的發(fā)揮。胃蛋白酶和胰蛋白酶是胃腸道環(huán)境中的兩種重要肽類(lèi)水解酶，體外具有活性的肽段容易被胃蛋白酶和胰蛋白酶裂解，使其影響活性的關(guān)鍵氨基酸丟失，造成體外有活性而體內(nèi)無(wú)活性的結(jié)果?？刮傅鞍酌负鸵鹊鞍酌噶呀饽芰?duì)蛋清降壓肽在體內(nèi)穩(wěn)定存在至關(guān)重要。因此，實(shí)驗(yàn)著重研究了蛋清降壓肽的抗胃腸道蛋白酶裂解的能力。實(shí)驗(yàn)中按照《中華人民共和國(guó)藥典》第五部的要求制備人工模擬胃腸液(人工胃液的配制：人工胃液取稀鹽酸16.4mL，加水約800mL與胃蛋白酶10g，搖勻后，加水衡釋至1000mL；人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，取胰蛋白酶10g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000mL即得)。取上述配制的人工胃液，人工腸液各10mL配制成10mg/mL的肽溶液，于37℃條件下胃液反應(yīng)5h，腸液反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后在100℃加熱15min，5000×g，－4 ℃條件下離心5min。按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行活性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性

蛋清降壓肽生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過(guò)程中，影響其血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的因素較多。通過(guò)PB設(shè)計(jì)對(duì)可能影響蛋清降壓肽活性穩(wěn)定性的因素進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。利用Minitab 15.1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表2 蛋清降壓肽化學(xué)穩(wěn)定性Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of antihypertensive peptide stability determined by Plackett-Burman design

圖 1 蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)Pareto圖Fig.1 Standardization effect of antihypertensive peptides from egg white protein

圖2 蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)正態(tài)圖Fig.2 Normal distribution of standardization effect of antihypertensive peptides from egg white protein

按表2選定的各因素進(jìn)行試驗(yàn)，取樣測(cè)定酶活并取3次測(cè)量值的平均值分別計(jì)算各因素效應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)分布，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。根據(jù)效應(yīng)和系數(shù)估計(jì)值中溫度、空氣、巴氏殺菌和Mg2+的效應(yīng)和系數(shù)均為正值，表明溫度、空氣、巴氏殺菌和Mg2+為影響蛋清蛋白質(zhì)降壓肽降壓活性的正相關(guān)因素。但通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)圖來(lái)看，所考察的8個(gè)因素對(duì)蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的化學(xué)穩(wěn)定性影響均不顯著。

2.2 蛋清降壓肽酶穩(wěn)定性

通過(guò)模擬胃腸道環(huán)境實(shí)驗(yàn)，蛋清蛋白質(zhì)降壓肽經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性明顯下降(表3)。胰蛋白酶水解位點(diǎn)為賴氨酸和精氨酸的羧基端，胃蛋白酶的水解位點(diǎn)為苯丙氨酸、蘇氨酸和色氨酸的氨基端，這可能因?yàn)榫哂醒芫o張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽段經(jīng)胃蛋白酶或胰蛋白酶水解而失去或部分失去活性。但由于蛋清蛋白質(zhì)降壓肽成分復(fù)雜，不能確定經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理前后的活性肽結(jié)構(gòu)的變化。

表3 降壓肽模擬體內(nèi)環(huán)境處理結(jié)果Table 3 Results of antihypertensive peptide stability in mimic gastrointestinal environment

3 結(jié) 論

蛋清蛋白質(zhì)降壓肽具有耐熱性，在酸性和堿性條件下活性均很穩(wěn)定，蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性受超聲、光照和鎂離子等因素影響不顯著，但其他金屬離子對(duì)其活性穩(wěn)定性的影響程度還需進(jìn)一步深入研究。蛋清蛋白質(zhì)降壓肽對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性不強(qiáng)，分別經(jīng)兩種酶處理后降壓肽活性明顯下降。Miguel等[16]研究表明蛋清胃蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有降壓作用。Fujita等[17]研究也表明來(lái)源蛋清的一種8肽經(jīng)乳化喂養(yǎng)SHR后，降壓效果明顯提高，這可能是經(jīng)乳化的活性肽提高了胃腸道酶的耐受性。

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Stability of Antihypertensive Peptides from Egg White Protein to Chemicals and Enzymes

YU Zhi-peng，ZHAO Wen-zhu，YU Yi-ding，LIU Bo-qun，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology,Jilin University, Changchun 130062, China)

The stability of antihypertensive peptides from egg white protein to chemicals was evaluated by Plackett-Burman design and its stability in mimic gastrointestinal environment was also investigated by determining angiotensin converting enzyme activity. Results indicated that pH, temperature, light illumination, stock peptide concentration, Pasteurization treatment,ultrasonic treatment and magnesium ions had no significant effect on the stability of antihypertensive peptides. However, the stability of antihypertensive peptides was sensitive to pepsin and trypsin. The activity of antihypertensive peptides decreased to 13.0 % and 4.0 % from 46.0 %.

egg white protein；peptide；stability；angiotensin converting enzyme

TS253.1

A

1002-6630(2010)09-0023-04

2009-09-24

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z329)

于志鵬(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與功能食品。E-mail：yuzhipeng20086@sina.com

劉靜波(1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com